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目的:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种高度恶性的肿瘤,其死亡率在癌症死因中高居第三位。HCC作为常见实体肿瘤之一,同其它实体肿瘤一样,由于瘤体的不断增长,血供及营养相对不足,瘤体中心的肿瘤细胞常常处于一种低氧微环境状态。低氧微环境导致组织氧张力降低从而影响肿瘤细胞基因表达和细胞功能的改变。肿瘤细胞通常会通过衍化出不同的表型,从而逃离或者适应恶劣的生存环境。其中低氧会导致HCC细胞自噬平衡的改变,这种改变往往导致肿瘤细胞化疗耐药性的产生和放疗敏感性的降低,最终导致HCC病人临床治疗效果不佳及预后不良。自噬能够通过调节及回收包括线粒体在内的受到损伤的细胞器,为细胞提供功能性生物合成,属于一种较为保守的维持细胞稳态的生物进程。自噬平衡的改变在肿瘤的发生发展过程中起到了至关重要的作用。在HCC发生发展过程中,自噬能够调节包括侵袭迁移、增殖、耐药等在内的多个细胞生物学行为。此外,癌基因的异常激活在HCC分子发病机制中起到至关重要的作用。低氧微环境往往会使肿瘤细胞不同的基因发生异常改变从而改变肿瘤细胞生物学行为。低氧环境下,多种长链非编码RNA（long non-coding RNA,Lnc RNA）表达异常。Lnc RNA是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。Lnc RNA在包括肿瘤在内的疾病的发生发展过程中同样扮演着重要的角色。Lnc RNA可以通过RNA和DNA间的相互作用等方式参与对蛋白质的调控,最终参与到细胞不同的生物学行为的改变进程,从而发挥其生物学效应。Lnc RNA可以调节许多关键的信号通路,从而改变包括细胞增殖、侵袭迁移、凋亡、自噬等在内的多个肿瘤细胞生物学行为,继而影响肿瘤发生发展的进程。Lnc RNA-ROR（Long noncoding RNA Regulator of Reprogramming）作为Lnc RNA家族的一员最早在诱导多能干细胞的过程中被鉴定出来。在HCC中Lnc RNA-ROR受到低氧微环境的调控异常高表达,并促进HCC细胞侵袭迁移以及囊泡释放等生物进程。那么,Lnc RNA-ROR能否参与低氧调控HCC细胞自噬的过程并影响HCC的发生发展?本课题通过细胞功能实验,组织标本检测及体内实验探索Lnc RNA-ROR调节HCC细胞低氧诱导自噬的具体机制,从而为HCC的临床诊治提供新的方向、思路与理论基础。研究方法:1.（1）低氧处理HCC细胞,应用免疫印迹实验（Western blot）检测LC3、P62蛋白表达、免疫荧光检测LC3表达、透射电镜观察自噬小体;（2）应用生物信息技术筛选低氧相关Lnc RNA,实时荧光定量PCR（real-time quantitative reverse transcription PCR,real-time PCR）检测Lnc RNA表达;应用脂质体转染技术,HCC细胞转染pc DNA-ROR/si-ROR,构建高/低表达Lnc RNAROR的HCC细胞系,低氧处理,应用Western blot检测LC3、P62蛋白表达、免疫荧光检测LC3表达;2.（1）低氧处理高/低表达Lnc RNA-ROR的HCC细胞系中检测自噬相关基因（Autophagy relative genes,ATGs）,应用real-time PCR及Western blot检测ATGs表达改变;（2）应用生物学信息技术筛选Lnc RNAROR下游靶基因mi RNA;（3）应用脂质体转染技术,HCC细胞转染mi R-129-5p mimics与mi R-129-5p inhibitor,构建高/低表达mi R-129-5p HCC细胞系,低氧处理,Western blot检测ATG5改变情况;（4）低氧处理高/低表达Lnc RNA-ROR HCC细胞系,应用Real-time PCR检测mi R-129-5p表达情况;（5）应用荧光素酶报告基因、RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP）实验、RNA pull down实验验证Lnc RNA-ROR与mi R-129-5p的结合;（6）应用脂质体转染技术,HCC细胞共转染pc DNA3.1-ROR与mi R-129-5p mimics,应用Western blot检测ATG5表达情况;3.（1）选取46例HCC病人癌症组织及癌旁组织,应用real-time PCR检测HCC组织Lnc RNA-ROR的表达,检测ATG5m RNA表达水平,并作相关性分析;（2）构建稳定过表达Lnc RNA-ROR表达HCC细胞系,裸鼠皮下成瘤,测量瘤体大小,绘制生存曲线,Western blot检测肿瘤组织LC3、P62表达,免疫组化检测ATG5、Ki67表达。结果:1.（1）低氧处理HCC细胞后,Western blot显示LC3II/I明显升高,P62降低,免疫荧光显示LC3荧光斑点表达增多并聚集,电镜下观察到自噬小体,提示低氧促进HCC细胞自噬;（2）生物信息技术筛选Lnc RNA,提示Lnc RNAROR可能参与低氧诱导HCC细胞自噬进程;低氧处理高/低表达Lnc RNA-ROR的HCC细胞系,Western blot结果显示si-ROR组LC3II/I表达降低,P62表达升高,反之,pc DNA-ROR组LC3II/I表达升高,P62表达降低;免疫荧光显示siROR组LC3荧光斑点表达降低并分散,反之,pc DNA-ROR组LC3荧光斑点表达升高并聚集;2.（1）低氧处理低表达Lnc RNA-ROR的HCC细胞系,检测自噬相关基因家族,real-time PCR结果表明ATG5 m RNA降低最明显,低氧处理高/低表达Lnc RNA-ROR HCC细胞系,Western blot结果显示pc DNA-ROR组中ATG5蛋白表达升高,si-ROR组ATG5蛋白表达降低;（2）应用生物学信息技术确定Lnc RNA-ROR下游靶基因,结果表明mi R-129-5p可能参与Lnc RNA-ROR调节ATG5表达;构建高/低表达mi R-129-5p细胞系,低氧处理,Western blot检测显示过表达/敲低mi R-129-5p能够使ATG5表达降低/升高;（3）荧光素酶报告基因实验显示Lnc RNA-ROR与mi R-129-5p能够结合,RIP实验与RNA pull down实验显示Lnc RNA-ROR与mi R-129-5p存在结合位点;（4）HCC细胞共转染pc DNA-ROR与mi R-129-5p mimics,进行回复实验,结果显示mi R-129-5p mimics能够抑制由于过表达Lnc RNA-ROR所导致的ATG5蛋白表达增高;3.（1）GEPIA网站分析肿瘤组织中Lnc RNA-ROR表达,Lnc RNA-ROR的表达明显高于癌旁组织;应用real-time PCR检测46例HCC病人HCC组织及癌旁组织中Lnc RNAROR及ATG5 m RNA的表达,结果表明HCC组织中Lnc RNA-ROR及ATG5m RNA表达明显高于癌旁组织,且两者表达呈正相关;（2）构建稳定过表达Lnc RNA-RORHCC细胞系,裸鼠皮下成瘤,结果显示相较于vector组,ROR-OE组瘤体生长速度快、体积大;Western blot检测小鼠肿瘤组织LC3,P62表达,结果显示,相较于vector组,ROR-OE组LC3II/I明显升高,P62明显降低,免疫组化检测ATG5、Ki67表达,相较于vector组,ROR-OE组ATG5、Ki67表达升高。结论:1.低氧微环境能够促进HCC细胞自噬;2.低氧微环境能够通过上调lnc RNA-ROR的表达促进HCC细胞自噬;3.低氧微环境下,lnc RNA-ROR通过调节ATG5表达调节HCC细胞自噬;4.Lnc RNA-ROR通过海绵效应调节mi R-129-5p的表达,进而调节ATG5表达;5.HCC组织中lnc RNA-ROR呈高表达;6.Lnc RNA-ROR在HCC组织中与ATG5的表达呈正相关趋势;且高表达lnc RNAROR病人生存周期更短;7.Lnc RNA-ROR能够促进肿瘤生长,提高肿瘤细胞增殖能力,并促进肿瘤细胞自噬。综上所述,在HCC细胞中lnc RNA-ROR能够通过海绵效应调节ATG5表达从而介导低氧诱导HCC细胞自噬,lnc RNA-ROR是潜在HCC临床诊断分子标志物及潜在治疗靶点。