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目的:随着手术技术的不断提高和麻醉学科的不断发展,孕期手术的开展日益增多,妊娠期麻醉的需求也不断增长。吸入性麻醉药作为宫内手术的首选麻醉方法,其神经毒性这一话题成为麻醉学科和社会关注的焦点。孕中期一直被临床上视为孕期手术的相对安全时期,绝大部分孕妇非产科手术均在孕中期进行,以保证部分胎儿疾病可以得到早期干预和治疗。但随着大量的动物实验表明常用的吸入性麻醉药物会影响未成熟大脑的发育,造成认知功能的损害,人们逐渐意识到,相对安全的手术期并不意味着是相对安全的麻醉期。孕中期作为神经系统发育的关键时期,神经系统正处于大量增殖、分化及迁移的神经发生过程中,此时外界的细微影响（如药物或环境）均可能会导致远期神经系统发育的异常。近年来已有多篇关于孕中期母体麻醉药暴露对子代神经干细胞产生影响的研究报道,但其机制尚未明确。课题组的前期研究中已表明,孕中期大鼠连续三日暴露于3%浓度的吸入性麻醉药七氟醚2小时（h）后,影响了子代的神经系统发育及远期学习记忆能力,但单次3%浓度七氟醚暴露对子代大脑发育影响甚微。孕中期大鼠暴露于3.5%七氟醚2h后,可引起子代大脑中神经干细胞的过度自噬,从而导致其过度凋亡和增殖抑制,而暴露于2%七氟醚2 h的子代大脑并未表现出神经干细胞凋亡与增殖的异常。这表明吸入性麻醉药七氟醚对子代神经系统的影响与吸入的浓度、时间或暴露次数有关。近年来越来越多的研究表明麻醉药物能导致神经干细胞的分化水平异常。细胞周期决定细胞命运,一旦设定的细胞进程被打破,就可能导致严重的后果。神经分化作为神经系统发育中至关重要的过程,过早或抑制神经分化均可导致远期的神经系统发育障碍。在神经系统发育过程中,有多个基因参与维持神经干细胞的干性,使神经干细胞按照设定进行分化。有文献报道ATN1是维持神经干细胞干性的一个关键基因。我们的预实验结果也表明多次七氟醚麻醉后可导致子代大鼠和原代海马神经干细胞内的ATN1表达水平下降。目前尚未有关于不同暴露次数的七氟醚对于神经干细胞分化的影响及其机制的相关研究,因此本研究旨在探究七氟醚是否通过调控ATN1表达水平影响神经干细胞的分化水平。MicroRNAs（miRNAs）是一类由内源基因编码,高度保守的,长度仅约为20-24个核苷酸的单链非编码RNA,在生物体内有着重要的调控作用。已有多篇文献报道miRNAs在神经系统发育过程中有着重要作用。我们通过生物学软件预测mi R-410-3p与ATN1有特异性靶向结合位点并通过实验证明了其靶向结合能力。实验结果表明,多次七氟醚麻醉后,原代海马神经干细胞内的mi R-410-3p的表达水平上升。本研究旨在探究mi R-410-3p在七氟醚导致神经干细胞分化异常过程中的作用。综上所述,本研究旨在明确大鼠在孕中期单次与多次七氟醚暴露后对子代大鼠海马神经干细胞分化的影响,并拟探究七氟醚通过调控mi R-410-3p和ATN1表达水平影响海马神经干细胞的分化作用。研究方法:1、实验动物选择Sprague Dawley（SD）大鼠,进行合笼后记录孕期时间,孕鼠于孕期（Gestational,G）14日接受3%七氟醚麻醉2 h一次或G13、G14、G15连续三日接受3%七氟醚麻醉2 h,麻醉结束后于24 h,72 h及子代出生后28天（Postnatal,P28）利用Western Blot和免疫荧光实验方法检测神经干细胞标记物Nestin、神经元标记物β-tubulin III及星形胶质细胞标记物GFAP以观察神经干细胞分化情况。2、原代神经干细胞取自G14-16的SD大鼠海马区并通过免疫荧光验证其干性及分化能力,培养并传代至2-4代进行单次4.1%七氟醚麻醉2 h或连续3日4.1%七氟醚麻醉2 h,麻醉结束后于24 h,72 h及28 d通过Western Blot和免疫荧光实验观察七氟醚对神经干细胞分化的影响。3、前期实验发现七氟醚处理后ATN1表达水平降低,导致神经干细胞提前分化。构建ATN1过表达慢病毒载体感染神经干细胞,空载病毒感染的神经干细胞为阴性对照组,进行多次七氟醚麻醉后于上述相同时间点通过RT-q PCR、Western Blot和免疫荧光实验检测ATN1表达水平及神经干细胞的分化情况。4、利用生物学软件对可能调控ATN1表达水平的mi RNA进行分析预测,筛选出ATN1可能为mi R-410-3p的潜在靶基因,并利用双荧光素酶报告确认mi R-410-3p与ATN1靶向结合。5、预实验结果表明七氟醚处理后海马神经干细胞内mi R-410-3p表达水平升高,构建mi R-410-3p敲减慢病毒载体感染神经干细胞,进行多次七氟醚麻醉后,通过RT-q PCR、Western Blot和免疫荧光实验检测mi R-410-3p和ATN1表达水平及神经干细胞的分化情况。结果:1、母体单次七氟醚麻醉后子代大鼠海马神经干细胞的Nestin、β-tubulin III和GFAP蛋白表达水平,β-tubulin III和GFAP阳性细胞数与对照组相比无统计学差异。多次七氟醚吸入导致子代大鼠海马神经干细胞在24 h和72 h时Nestin蛋白表达水平下降,β-tubulin III和GFAP蛋白表达水平升高,β-tubulin III和GFAP阳性细胞数增多;在生后28 d时β-tubulin III蛋白表达水平降低,GFAP蛋白表达水平升高,海马CA1区β-tubulin III阳性细胞数减少,GFAP阳性细胞数增多。2、单次七氟醚麻醉后原代海马神经干细胞的Nestin、β-tubulin III和GFAP蛋白表达水平,β-tubulin III和GFAP阳性细胞数与对照组相比无统计学差异。多次七氟醚麻醉导致原代海马神经干细胞在24 h和72 h时Nestin蛋白表达水平下降,β-tubulin III和GFAP蛋白表达水平升高,β-tubulin III和GFAP阳性细胞数增多;在28 d时β-tubulin III蛋白表达水平降低,GFAP蛋白表达水平升高,β-tubulin III阳性细胞数减少,GFAP阳性细胞数增多。3、多次七氟醚麻醉导致子代大鼠神经干细胞和原代海马神经干细胞的ATN1表达水平下降;ATN1过表达并进行七氟醚麻醉后,在24 h和72h,与多次七氟醚麻醉组相比,ATN1、Nestin表达水平明显升高,β-tubulin III和GFAP表达水平降低,β-tubulin III和GFAP阳性细胞数明显减少;在28 d,β-tubulin III表达水平升高,GFAP表达水平降低。4、ATN1可与mi R-410-3p靶向结合。5、多次七氟醚麻醉导致神经干细胞内mi R-410-3p表达水平上升;mi R-410-3p沉默并进行七氟醚麻醉后,在24 h和72 h,与多次七氟醚麻醉组相比,mi R-410-3p表达水平明显降低,ATN1、Nestin表达水平升高,β-tubulin III和GFAP表达水平降低,β-tubulin III和GFAP阳性细胞数明显减少;在28 d,β-tubulin III表达水平升高,GFAP表达水平降低。结论:1、多次七氟醚麻醉导致子代大鼠神经干细胞及原代海马神经干细胞过早分化为神经元和星形胶质细胞,并在远期导致神经元减少和星形胶质细胞增加;单次七氟醚麻醉对子代大鼠神经干细胞及原代海马神经干细胞的分化并无影响。2、多次七氟醚麻醉后海马神经干细胞内ATN1表达水平下降,ATN1过表达可减轻七氟醚对原代大鼠海马神经干细胞早期及远期分化水平的影响;单次七氟醚麻醉对神经干细胞内ATN1表达水平无影响。3、ATN1与mi R-410-3p靶向结合;多次七氟醚麻醉后海马神经干细胞内mi R-410-3p表达水平上升,mi R-410-3p沉默可减轻七氟醚对原代大鼠海马神经干细胞早期及远期分化水平的影响;单次七氟醚麻醉对神经干细胞内mi R-410-3p表达水平无影响。