论文部分内容阅读
上皮细胞向问充质细胞的转变(epithelial-mensenchymal transition，EMT)在胚胎发育、纤维化疾病、以及肿瘤的浸润和转移中起着关键性作用。为全面了解EMT过程中分子变化情况，我们以小鼠肝细胞系AML-12细胞为体系，应用比较蛋白质组学方法，对转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)诱导的EMT进行了分析，识别并鉴定了36个表达有显著性差异的蛋白质。在这36个蛋白分子里面，我们发现了并阐述了细胞内铁离子的储存蛋白一铁蛋白的重链(ferritin heavy chain，FHC)—在调控TGF-β1诱导EMT中的作用及其机制。TGF-β1可显著地降低胞内FHC的蛋白水平，引起FHC中储存铁离子的释放，从而增加细胞内的可变铁库(labileiron pool，LlP)。阻止可变铁库的增加能阻断TGF-β1诱导EMT。我们进一步发现，可变铁库的增加促进了活性氧分子(reactive oxygen species，ROS)的生成及有丝分裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)p38的活化。清除ROS能抑制EMT，而加入H2O2能使因可变铁库的增加受到阻断从而不能发生EMT的细胞重新恢复EMT。过表达外源性的FHC能减弱可变铁库的增加和ROS的生成，进而抑制EMT。另外，我们还发现TGF-βl下调FHC的表达是通过依赖于3UTR序列的FHC mRNA的翻译的翻译抑制而实现的。而且，可以检测到在早期食管癌向高浸润性的晚期进展过程中有FHC水平的下调。阻断可变铁库和ROS的增加能抑制肿瘤细胞的迁移。总之，本研究显示了FHC以及它所调控的胞内铁离子平衡在TGF-β1诱导的EMT过程中起着重要的作用。
在肝细胞，TGF-β1能诱导G2/M期依赖的凋亡和G1/S期依赖的EMT，然而其调节机制尚不清楚。我们用双向电泳研究了同步化在G2/M期及G1/S期的AML-12小鼠肝细胞在TGF-β1诱导不同时间点后的蛋白质组变化。根据实验结果，我们发现TGF-βl可诱导谷氨酰胺合成酶在G2/M期细胞内发生时间依赖性下调，而在G1/S细胞并不诱导下调，并对该结果用免疫印迹法进行了验证。我们还发现，加入外源性谷氨酰胺能完全阻断G2/M期细胞或非同步化细胞在TGF-β1诱导下的凋亡，对TGF-β1诱导的EMT则没有明显影响。该结果对阐明TGF-β1的多功能效应以及凋亡和EMT的调控机制提供了新的线索。
Cortactin是一种调控细胞运动和黏附连接组装的F-actin结合蛋白。它在EMT中的作用尚不清楚。我们发现在AML-12细胞TGF-β1诱导EMT的过程中，cortactin的酪氨酸磷酸化水平显著降低。酪氨酸磷酸酶抑制剂能抑制TGF-βl诱导的cortactin的去磷酸化以及EMT。RNA干扰沉默cortacfin的表达引起胞间连接蛋白E-cadherin和ZO-1的蛋白水平明显降低，并且诱导间充质细胞标记蛋白纤维连接蛋白(fibronectin)的增加。不仅如此，沉默cortactin的表达能促进TGF-β1诱导的EMT特征性的形态学变化和标志性蛋白分子的变化，并且增强了TGF-β1诱导的细胞迁移。这些实验结果提示cortactin参与了TGF-β l诱导的EMT。