论文部分内容阅读
TNF相关的凋亡诱导配体(TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL)TRAIL是继TNF、FasL之后发现的第三个TNF家族的凋亡分子，是Wiley等从人心肌cDNA文库中克隆出来的。相对于TNF-α和Fas-L而言，TRAIL不仅具有更广的抗癌谱，能够诱导多种肿瘤细胞凋亡，并同时保护正常细胞免于细胞毒性反应，而且对NF-κB仅有很微弱的激活作用，即使是全身用药，也不会像TNF-α和Fas-L那样产生严重的炎症反应。无论是直接蛋白应用还是基因治疗，无论是单独应用还是联合用药，TRAIL对动物肿瘤均表现出强烈的抑制作用。毒副作用小、特异性强等这些特性提示TRAIL将可能成为新的抗肿瘤制剂。为了进一步研究其生物功能，本研究中，我们用大肠杆菌系统构建克隆表达TRAIL蛋白并用双岐杆菌作为TRAIL的载体进行抗肿瘤研究。主要研究结果如下：
1.为了获得大批量纯化的TRAIL蛋白，我们建立了新的TRAIL的大肠杆菌表达系统。用PCR方法从质粒pET28a-TRAIL扩增得到人TRAIL基因(114-281)，酶切pBV22210-Endostatin和TRAIL的PCR片段并回收pBV22210载体片段和TRAIL，将TRAIL克隆到带His标签的表达载体pBV22210中后在含氯霉素的琼脂平板上筛选出阳性克隆。将pBV22210-TRAIL导入大肠杆菌经温控诱导目的蛋白表达，表达产物经超声处理后利用Ni柱进行纯化并作SDS-PAGE分析，结果显示带His-tag的重组人TRAIL蛋白纯度和表达量较低，达不到进一步检测体内外活性的要求，不便于大批量表达纯化。
2.本实验前期研究构建了能在长双岐杆菌中稳定复制而对长双岐杆菌自身的生理特性并无明显影响的质粒pBV22210-Endostatin。将pBV22210-TRAIL电转导长双岐杆菌并经PCR方法鉴定，观察其糖酵解特征和生长曲线后检测转TRAIL基因的长双岐杆菌在荷瘤小鼠体内的分布以及肿瘤内定植情况，并将转TRAIL基因的长双岐杆菌分别与低剂量阿霉素(ADM，5 mg/kg)及转Endostatin基因的长双歧杆菌联合应用对荷瘤小鼠进行抗肿瘤治疗。结果表明转TRAIL基因的长双岐杆菌能够在肿瘤内选择性定植，随着时间的推移，正常组织中的活菌数不断减少而肿瘤组织中的活菌数却逐步增多。注射结束96h后，正常组织如心、肝、脾、肺、肾等中几乎无活菌生长。联合用药显示转TRAIL，基因的长双歧杆菌与转Endostatin基因的长双歧杆菌及低剂量ADM联用具有增强效应，联合用药组的肿瘤抑制率均超过70％而转TRAIL基因的长双歧杆菌单独应用抑瘤率只有55％左右，联用组比单独用药组抑瘤效果明显提高。研究表明双歧杆菌可以作为一种有效的目的基因载体，低剂量化疗药物与转基因双岐杆菌的联合应用可作为一种新的以定向诱导凋亡为基础的抗肿瘤方法。