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叶片衰老是植物的一种器官水平上的细胞程序性死亡过程,它受环境、植物激素等内外源因素的调控。WD-repeat蛋白是指包含重复的色氨酸(tryptophan,W)和天冬氨酸(aspartic acid,D)保守二肽的一类蛋白,普遍存在于真核生物中。果蝇的WDS(WillDieSlowly)基因编码的蛋白属于WD-repeat蛋白,它与细胞程序性死亡密切相关,该基因发生缺失突变时可导致果蝇在幼虫阶段发生死亡。拟南芥中有8个基因与果蝇WDS同源性较高。本实验以Col-0生态型拟南芥为材料,检测同源性较高3个基因:At5g08560(WDS1)、At5g64730(WDS2)和.Atlg73720(WDS3)在Col-0生态型拟南芥中时空表达情况,以及不同浓度的水杨酸溶液处理后3个基因的表达情况。筛选出3个AtWDS基因T-DNA插入突变体的纯合子,并对突变体植株进行表型观察。具体结果如下:
1.分别在Col-0生态型拟南芥11个不同发育阶段取材,用Real Time PCR检测3个AtWDS基因在花、老叶、幼叶、全叶中的表达,结果表明:3个基因在植株各个生长时期均有表达,且变化趋势基本一致;其中,第一个果荚开裂时,3个基因在老叶中的表达量最高。
2. Real Time PCR检测到3个AtWDS基因在Col-0生态型拟南芥的茎生叶、莲座叶、茎、根、果荚和花中均有表达,说明3个基因的表达没有组织特异性。
3. SA处理生长4周龄的Col-0生态型拟南芥叶片后,Real Time PCR检测3个AtWDS基因表达量的差异,结果表明:与对照组(H2O处理)相比,0.5 mM的SA溶液喷洒植株48 h后3个基因的表达量达到峰值,此外,WDS3在SA喷洒后72 h仍维持较高水平。
4.通过三引物PCR、Kan抗性筛选技术筛选出3个 AtWDS基因突变体的纯合植株,RT-PCR 结果表明这3个基因在各自的突变体中无任何表达。
5.对突变体表型分析表明,在正常生长条件下,wds2、wds3植株和Col-0生态型拟南芥形态学上没有明显差异;而wds1表现出花期推迟和叶片早衰的表型,推测WDS1与调节花期、延缓叶片衰老有关。