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水稻是重要的粮食作物,为全球一半以上的人口提供主要粮食来源。干旱、高盐、低温和高温等非生物逆境胁迫严重影响水稻的生长发育,对水稻产量造成巨大损失。为保证水稻的稳产、高产,培育对非生物胁迫逆境具有一定耐受性的品种是关键,而鉴定水稻耐逆功能基因是研究水稻耐逆分子机理和利用基因工程方法创制耐逆品种的重要前提。 为发掘新的水稻耐逆功能基因,我们采用Affymetrix水稻表达芯片(含51279个转录本)分析了培矮64S在低温、干旱、高温胁迫下不同生育时期、不同组织器官全基因组水平的表达模式,前期试验结果发现水稻培矮64S中一些在多逆境诱导下表达量显著升高和降低的基因。OsMsr15和OsMsr16(Oryza sativaL.Multi-Stress Responsive gene15,16)即为其中两个受低温、高温、干旱同时诱导表达的耐逆候选基因。我们初步分析了OsMsr15和OsMsr16在调控植物应答非生物胁迫中的功能和作用机制。主要研究结果如下: 1.水稻C2H2转录因子基因OsMsr15的克隆和功能解析 OsMsr15位于水稻第3号染色体上(LOC_Os03g41390),无内含子,cDNA全长902bp,编码一个含238个氨基酸残基的蛋白。预测相对分子质量为24.6kD,等电点为8.90。OsMsr15具有两个C2H2型锌指结构域,在其N末端存在预测的核定位信号序列B-box(RKRS RRRHRDR)和亮氨酸富集区(L-box),在氨基酸序列的C末端存在一个EAR-motif,即L/FDLNL/F(x)P特征序列,该序列具有转录抑制活性。OsMsr15-GFP融合蛋白主要定位于洋葱表皮细胞的细胞核中,酵母单杂交实验表明,OsMsr15在酵母细胞中具有转录激活活性。过量表达OsMsr15增强拟南芥的耐早性,转基因拟南芥离体叶片的失水率低于野生型拟南芥离体叶片的失水率。转基因植株在干旱胁迫条件下的相对电解质渗透率低于野生型植株,脯氨酸含量高于野生型植株。另外,ABA敏感性实验显示过量表达拟南芥植株显著提高对外源ABA的敏感性。过量表达OsMsr15改变了拟南芥中逆境响应基因(RD29A、P5CS1、LEA3和DREB1A)的表达模式。 2.水稻PHD finger转录因子基因OsMsr16的克隆和功能解析 OsMsr16位于水稻第11号染色体上(LOC_Os11g12650),包含5个外显子区和4个内含子区,cDNA全长2323 bp,完整的ORF(open reading frame)为2148 bp,编码蛋白质含715个氨基酸残基,蛋白约80.2 kD,pI为8.62,在其C端含有一个由Cys-X1-Cys-X12-Cys-X2-Cys-X4-His-X2-Cys-X15-Cys-X2-Cys序列组成的保守的C4HC3型PHD锌指结构域。OsMsr16在水稻的苗期、孕穗期和抽穗期受到高温、低温、干旱和高盐胁迫诱导表达。芯片信息显示OsMsr16基因在水稻的根、叶、胚、胚乳等各个组织器官和幼苗中均有不同水平的表达,其中在叶和幼苗中的表达量最高。正常生长条件下,野生型和转基因植株的生长和发育没有明显差异。高盐胁迫条件下,过量表达OsMsr6水稻的存活率高于野生型对照。过表达植株在盐处理条件下,体内脯氨酸和可溶性糖含量升高,丙二醛和双氧水含量降低,同时ROS清除酶SOD和CAT的活性增强。以上结果表明,过量表达OsMsr16提高了转基因水稻的耐盐能力。