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目的：
将有促进软骨细胞增值作用的TGF-β1与藻酸钙凝胶有机结合，探索组织工程合适载体，了解TGF-β1对体外培养的藻酸钙凝胶中脂肪干细胞向软骨细胞诱导分化的作用，为关节软骨缺损的修复提供实验依据
实验材料：
6周龄Wister大鼠(250g-300g)，雌雄不限，(中国医科大学实验动物中心提供)；高糖DMEM培养基(Gibco，美国)；I型胶原酶(Sigma，美国)；鼠尾胶原(杭州生友生物技术有限公司)；地塞米松，ITS+，牛血清白蛋白，维生素C(Sigma，美国)，转化生长因子β1(PeproTech，美国)；藻酸钙凝胶，II型胶原多克隆抗体，SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德生物科技有限公司)；SRKLYOVAC GT2-9冷冻干燥机(德国)。
实验方法：
无菌条件下取双腹股沟脂肪组织约10毫升。充分剪碎约1立方毫米，0.1％的胶原酶和0.25％胰酶，37℃振荡消化15min，基础培养基终止消化，离心，弃上清，再用基础培养基重悬细胞，接种于培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中，饱和湿度条件下培养。20小时后首次换液，以后每三天换液一次，待细胞生长至接近融合时传代，7-10天达到80～90％融合时首次传代。取传到第4代的脂肪干细胞，消化，基础培养基重悬。藻酸钙凝胶(Matrixkit)置于12孔板内，完全培养基清洗3次；按每块5*106/ml将细胞悬液用无菌注射器滴于海藻酸钙凝胶表面的凹陷中每孔加10％FBS-DMEM完全培养基于37℃，5％CO2条件下培养2d。24小时将基础培养基半量换成诱导培养基(转化生长因子β150mg/L)，再过24小时后全量换为诱导培养基，此后每3天换液一次。
实验结果：
1.细胞增殖检测：接种细胞后增殖，随着时间延长MTT值升高。
2、大体及显微镜观察
接种细胞悬液后，细胞呈圆形，类圆形附于载体上，随着时间的延长，细胞逐渐布满整个空隙，并有基质分泌，细胞被包埋于其分泌的基质中，细胞与细胞之间，细胞与载体之间紧密结合
3、HE染色
培养3周后HE染色可见大量的细胞外基质产生，细胞与细胞间以及细胞与载体间相互间紧密联结。
4、电镜观察
藻酸钙凝胶有网状的孔隙，利于细胞生长所需物质与能量交换及代谢产物排泄，细胞黏附于藻酸钙凝胶上，细胞伸展，生长良好，细胞被包埋在其分泌的基质中，细胞与细胞之间紧密结合，细胞与载体间紧密结合。
5、II型胶原免疫组化检测
免疫组化显示，载体复合物II型胶原呈阳性。
结论：
1、藻酸钙凝胶对细胞的培养是三维培养，藻酸钙凝胶表面积大，内部孔隙多，适合于细胞黏附和进行营养交换，有利于细胞附着，生长，增值。
2、TGF-β1不仅仅在软骨细胞体外培养过程中有促进作用，在藻酸钙凝胶载体上同样具有促脂肪干细胞向软骨细胞分化的作用
将有促进软骨细胞增值作用的TGF-β1与藻酸钙凝胶有机结合，探索组织工程合适载体，了解TGF-β1对体外培养的藻酸钙凝胶中脂肪干细胞向软骨细胞诱导分化的作用，为关节软骨缺损的修复提供实验依据
实验材料：
6周龄Wister大鼠(250g-300g)，雌雄不限，(中国医科大学实验动物中心提供)；高糖DMEM培养基(Gibco，美国)；I型胶原酶(Sigma，美国)；鼠尾胶原(杭州生友生物技术有限公司)；地塞米松，ITS+，牛血清白蛋白，维生素C(Sigma，美国)，转化生长因子β1(PeproTech，美国)；藻酸钙凝胶，II型胶原多克隆抗体，SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德生物科技有限公司)；SRKLYOVAC GT2-9冷冻干燥机(德国)。
实验方法：
无菌条件下取双腹股沟脂肪组织约10毫升。充分剪碎约1立方毫米，0.1％的胶原酶和0.25％胰酶，37℃振荡消化15min，基础培养基终止消化，离心，弃上清，再用基础培养基重悬细胞，接种于培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中，饱和湿度条件下培养。20小时后首次换液，以后每三天换液一次，待细胞生长至接近融合时传代，7-10天达到80～90％融合时首次传代。取传到第4代的脂肪干细胞，消化，基础培养基重悬。藻酸钙凝胶(Matrixkit)置于12孔板内，完全培养基清洗3次；按每块5*106/ml将细胞悬液用无菌注射器滴于海藻酸钙凝胶表面的凹陷中每孔加10％FBS-DMEM完全培养基于37℃，5％CO2条件下培养2d。24小时将基础培养基半量换成诱导培养基(转化生长因子β150mg/L)，再过24小时后全量换为诱导培养基，此后每3天换液一次。
实验结果：
1.细胞增殖检测：接种细胞后增殖，随着时间延长MTT值升高。
2、大体及显微镜观察
接种细胞悬液后，细胞呈圆形，类圆形附于载体上，随着时间的延长，细胞逐渐布满整个空隙，并有基质分泌，细胞被包埋于其分泌的基质中，细胞与细胞之间，细胞与载体之间紧密结合
3、HE染色
培养3周后HE染色可见大量的细胞外基质产生，细胞与细胞间以及细胞与载体间相互间紧密联结。
4、电镜观察
藻酸钙凝胶有网状的孔隙，利于细胞生长所需物质与能量交换及代谢产物排泄，细胞黏附于藻酸钙凝胶上，细胞伸展，生长良好，细胞被包埋在其分泌的基质中，细胞与细胞之间紧密结合，细胞与载体间紧密结合。
5、II型胶原免疫组化检测
免疫组化显示，载体复合物II型胶原呈阳性。
结论：
1、藻酸钙凝胶对细胞的培养是三维培养，藻酸钙凝胶表面积大，内部孔隙多，适合于细胞黏附和进行营养交换，有利于细胞附着，生长，增值。
2、TGF-β1不仅仅在软骨细胞体外培养过程中有促进作用，在藻酸钙凝胶载体上同样具有促脂肪干细胞向软骨细胞分化的作用