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腺苷脱氨酶(ADA)是嘌呤核苷酸代谢的关键酶,它能催化腺嘌呤核苷生成次黄嘌呤,是一种与免疫有关的酶。腺苷脱氨酶过多能够引起红细胞中腺嘌呤衍生物含量降低,可造成溶血性贫血。腺苷脱氨酶抑制剂调节胞内腺苷及脱氧腺苷水平,影响淋巴细胞的生长和功能,并能提高腺苷类似物的治疗效果。本研究旨在筛选和分离高活性的天然腺苷脱氨酶抑制剂,为开发腺苷类药物的保护剂和相关治疗药物打下基础。
1.腺苷脱氨酶抑制剂的筛选。通过对食药两用植物和微生物的大量筛选,应用HPLC检测酶促反应后腺苷的浓度变化来计算抑制剂的抑制活性,发现大豆乳清废水和荔枝果皮提取液能够抑制ADA活性。
2.大豆乳清废水中腺苷脱氨酶抑制剂的分离与鉴定。通过大孔吸附树脂、有机溶剂萃取和硅胶柱层析等方法对大豆乳清废水中的腺苷脱氨酶抑制剂进行分离。用HPLC分离纯化和LC-MS检测后,确定活性物质的结构。大豆乳清废水原液经大孔树脂吸附,用水和不同浓度的乙醇梯度洗脱,分别在高极性和低极性洗脱相中检测到ADA抑制活性。将两个组分中的活性成分分别分离纯化,鉴定为染料木苷和染料木素。
3.荔枝果皮提取物中ADA抑制剂的分离与鉴定。荔枝果皮的花青素提取物经HPLC分析,有两个主要的成分。用制备HPLC将这两个主要成分分离,检测他们对ADA的抑制效果。结果表明荔枝果皮提取物中ADA抑制剂为矢车菊素-3-芸香糖苷。
4.大豆乳清废水中抑制剂粗制品的制备、含量检测和对ADA抑制效果的测定。将大豆乳清废水浓缩到1/10体积,再用乙酸乙酯萃取三次,有机相浓缩后烘干至恒重。HPLC法测定粗提取物中染料木苷、染料木素、大豆苷元和黄豆苷的含量分别为:0.04％、0.46％、2.5％和0.36％。将得到的抑制剂粗制品配制成0.2 mg/mL至5 mg/mL不同的浓度梯度,并检测不同的浓度对ADA的抑制效果。结果表明,在抑制剂粗制品的浓度达到1.6 mg/mL时,ADA的活性完全被抑制。
5.几种黄酮类物质结构与活性关系的研究。分别选取大豆苷元、染料木素、染料木苷、槲皮素、芸香糖苷和矢车菊素-3-芸香糖苷几种物质研究结构与活性之间的关系。实验结果表明各种物质随着浓度的逐渐增加,对ADA的抑制效果越明显。并且在相同的浓度下,染料木素对ADA的抑制效果要强去其他几种物质。其余几种对ADA抑制的效果由强到弱依次是槲皮素、矢车菊素-3-芸香糖苷、染料木苷、芸香苷和大豆苷元。