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在临床麻醉和重症监护室中,麻醉机和呼吸机的应用对肺组织造成损伤,主要是由于机械因素引起的跨肺压、剪应力增大,肺泡的完整性遭到破坏,肺泡通透性增加,肺泡屏障功能受损,进而引起肺水肿,甚至急性肺损伤,即机械通气相关肺损伤（VILI）。目前机械通气相关肺损伤的发生机制尚未完全研究清楚,其发病机制研究主要集中在炎症反应、肺表面活性物质、肺表面张力和肺泡通透性四个方面。本研究主要是针对肺泡通透性在VILI发病机制中的作用进行研究。探讨在VILI中,上游基因和连接蛋白E-cadherin、Ocludin表达情况以及其作用机制。第一章 机械通气相关肺损伤中E-cadherin、Occludin及Elk1、MMP-9表达的情况目的探讨大潮气量机械通气对小鼠肺组织和20%机械牵张MLE-12细胞连接蛋白（E-cadherin、Occludin）以及 Elk1、MMP-9 表达的影响。方法1、体内实验:30只C57BL/6小鼠随机分为3组,每组10只,对照组（MV 0h组）、大潮气量机械通气2小时组（MV 2h组）、大潮气量机械通气4小时组（MV4h组）。对照组气管切开后,未进行大潮气量机械通气;MV2h组和MV4h组的机械通气参数:潮气量VT=20mL/kg,呼吸频率为40次/min,呼气末正压PEEP=0cm H2O,吸呼比I:E=1:2,机械通气时间为2h和4h。大潮气量机械通气后,进行HE染色、肺组织病理学评分、支气管肺泡灌洗液细胞总数、湿干重比、伊文氏蓝染料外渗,来评价肺组织损伤程度。免疫荧光共染色观察E-cadherin和Occludin蛋白的分布情况。蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）检测E-cadherin、Occludin、Elk1、MMP-9 的表达。2、体外实验:小鼠肺上皮细胞（MLE-12）随机分为3组,对照组（CS 0h组）、机械牵张2小时组（CS 2h组）、机械牵张4小时组（CS4h组）。CS 0h组不进行机械牵张,CS2h组和CS4h组进行机械牵张,牵张幅度为20%,牵张时间为2h、4h。机械牵张后,提取细胞总蛋白,WB检测E-cadherin、Occludin、Elk1、MMP-9的表达;剪取机械牵张基底膜,免疫荧光共染色观察E-cadherin和Occludin蛋白的分布情况。结果1.体内实验:HE染色发现,MV2h组小鼠肺组织肺泡充血,肺泡壁稍增厚,有部分小鼠出现透明膜;MV4h组的小鼠肺组织肺泡充血更加严重,有部分小鼠肺组织肺泡出血,肺泡壁增厚,肺泡透明膜形成。与MV 0h组小鼠比较,MV2h组、MV4h组小鼠肺组织损伤评分、湿干重比、伊文氏蓝染料外渗、支气管肺泡灌洗液中细胞总数均升高（P＜0.05）,随通气时间增加而升高。WB检测发现,与MV 0h组比较,MV 2h组、MV 4h组小鼠肺组织连接蛋白E-cadherin、Occludin表达降低（P＜0.05）,随通气时间增加而降低;Elk1、MMP-9表达升高（P＜0.05）,随通气时间增加而升高。免疫荧光发现,MV 2h组、MV 4h组小鼠肺组织E-cadherin和Occludin荧光表达量减弱,随时间增加而减弱。2.体外实验:免疫荧光发现,CS 2h组、CS 4h组MLE-12细胞连接蛋白E-cadherin和Occludin荧光表达量减弱,随时间增加而减弱。WB检测发现,与CS 0h组比较,CS 2h组和CS 4h组MLE-12细胞中连接蛋白E-cadherin、Occludin表达降低（P＜0.05）,随牵张时间增加而降低;Elk1、MMP-9表达升高（P＜0.05）,随牵张时间增加而升高。结论小鼠大潮气量机械通气后肺组织和20%机械牵张后MLE-12细胞导致E-cadherin、Occludin表达降低、肺泡通透性增加,导致肺损伤。通气和牵张的时间越长,损伤程度越高。第二章 Elk1和MMP-9干预在机械通气相关肺损伤中对E-cadherin、Occludin及通透性的影响目的探讨Elk1和MMP-9的干预在机械通气相关肺损伤中对连接蛋白E-cadherin和Occludin表达及肺泡通透性的影响。方法1.体外实验:MLE-12细胞随机分为8组,对照组（CS 0h组）、空白对照干扰组（si-Nc 组）、Elk1 干扰组（si-Elk1 组）、MMP-9 干扰组（si-MMP-9 组）、机械牵张4小时组（CS 4h组）、空白对照干扰+机械牵张4小时组（CS 4h+si-Nc组）、Elk1干扰+机械牵张4小时组（CS 4h+si-Elk1组）、MMP-9干扰+机械牵张4 小时组（CS 4h+si-MMP-9 组）。Negative control siRNA、Elk1 siRNA、MMP-9 siRNA转染MLE-12细胞48h后,提取细胞总蛋白进行WB检测Elk1、MMP-9的表达。CS 0h组不进行机械牵张;CS 4h组、CS 4h+si-Nc组、CS 4h+si-Elk1组、CS 4h+si-MMP-9组机械牵张参数:牵张幅度20%,频率0.5HZ,牵张和放松的比例为1:1,牵张时间为4h。机械牵张后,取细胞总蛋白进行WB检测E-cadherin、Occludin、Elk1、MMP-9的表达;剪取机械牵张膜,免疫荧光共染色观察E-cadherin和Occludin蛋白的分布情况。2.体内实验:40只C57BL/6小鼠随机分为4组,每组10只,对照组（MV 0h组）、大潮气量机械通气4小时组（MV 4h组）、Elk1干扰+大潮气量机械通气4小时组（MV 4h+si-Elk1组）、MMP-9干扰+大潮气量机械通气4小时组（MV 4h+si-MMP-9组）。MV 0h组小鼠气管切开后,未进行大潮气量机械通气;MV 4h+si-Elk1 组、MV4h+si-MMP-9 组小鼠尾静脉注射转染 Elk1 siRNA（2.5μg/g）、MMP-9 siRNA（2.5μg/g）72h后,进行大潮气量机械通气。MV 4h组、MV 4h+si-Elk1组、MV 4h+si-MMP-9组的机械通气参数:潮气量VT=20mL/kg,呼吸频率为40次/min,呼气末正压PEEP=0cm H2O,吸呼比I:E=1:2,机械通气时间为4h。大潮气量机械通气后,进行HE染色、肺组织病理学评分、支气管肺泡灌洗液细胞总数、湿干重比、伊文氏蓝染料外渗,来评价肺组织损伤程度。免疫荧光共染色观察E-cadherin和Occludin蛋白的分布情况。WB检测E-cadherin、Occludin的表达。结果1.体外实验:免疫荧光发现,CS 4h组小鼠肺组织的E-cadherin和Occludin荧光表达量减弱,CS 4h+si-Elk1组和CS 4h+si-MMP-9组小鼠肺组织的E-cadherin和Occludin荧光表达量较CS 4h组增强。WB检测发现,与si-Nc组比较,si-Elk1组的Elk1降低80%（P＜0.05）,si-MMP-9组MMP-9降低70%（P＜0.05）;与CS 4h 组比较,CS 4h+si-Nc 组中 E-cadherin、Occludin、Elk1、MMMP-9 表达差异无统计学意义（P＞0.05）;与 CS 4h+si-Nc 组比较,CS 4h+si-Elk1 组中 E-cadherin、Occludin 表达升高（P＜0.05）、Elk1 表达降低（P＜0.05）;与 CS 4h+si-Nc 组比较,CS 4h+si-MMP-9 组中 E-cadherin、Occludin 表达升高（P＜0.05）、MMP-9 表达降低（P＜0.05）。2.体内实验:HE染色发现,MV 4h组的小鼠肺组织肺泡充血、出血,肺泡壁增厚,肺泡透明膜形成。MV 4h+si-Elk1组、MV 4h+si-MMP-9组的小鼠肺组织肺泡充血、肺泡壁增厚现象,肺组织损伤情况降低。与MV 4h组小鼠比较,MV 4h+si-Elk1组、MV4h+si-MMP-9组小鼠肺组织损伤评分、湿干重比、伊文氏蓝染料外渗、支气管肺泡灌洗液中细胞总数均降低（P＜0.05）。WB检测发现,与MV 4h组小鼠比较,MV 4h+si-Elk1组小鼠肺组织E-cadherin、Occludin表达升高（P＜0.05）;与MV 4h组小鼠比较,MV 4h+si-MMP-9组小鼠肺组织E-cadherin、Occludin表达升高（P＜0.05）。免疫荧光发现,MV 4h组小鼠肺组织的E-cadherin和Occludin荧光表达量减弱,MV4h+si-Elk1组和MV4h+si-MMP-9组小鼠肺组织的E-cadherin和Occludin荧光表达量较MV 4h组增强。结论Elk1和MMP-9是机械通气相关肺损伤中调控连接蛋白的关键因子,Elk1和MMP-9干扰能改善大潮气量机械通气和病理性机械牵张导致的肺损伤。第三章 在机械通气相关肺损伤中Elk1与MMP-9相互作用及MMP-9/TIMP-1比例失衡目的探讨在机械通气相关肺损伤中Elk1与MMP-9相互作用及MMP-9/TIMP-1比例失衡。方法1.体外实验:MLE-12细胞随机分为6组,CS 0h组、si-Elk1组、si-MMP-9组、CS 4h 组、CS 4h+si-Elk1 组、CS 4h+si-MMP-9 组。si-Elk1 组和 si-MMP-9组在Elk1 siRNA、MMP-9 siRNA转染MLE-12细胞48后,提取细胞总蛋白。CS 4h+si-Elk1 组、CS 4h+si-MMP-9 组在 Elk1 siRNA、MMP-9 siRNA转染 MLE-12细胞48后行机械牵张。CS 0h组不进行机械牵张;CS 4h组、CS 4h+si-Elk1组、CS 4h+si-MMP-9组机械牵张,时间为4h。机械牵张后,取细胞总蛋白进行WB检测Elk1、MMP-9的表达。2.体内实验:40只C57BL/6小鼠随机分为4组,每组10只,对照组（MV 0h组）、大潮气量机械通气4小时组（MV 4h组）、Elk1干扰+大潮气量机械通气4小时组（MV 4h+si-Elk1组）、MMP-9干扰+大潮气量机械通气4小时组（MV 4h+si-MMP-9组）。MV 0h组小鼠气管切开后,未进行大潮气量机械通气;MV 4h+si-Elk1 组、MV 4h+si-MMP-9 组小鼠尾静脉注射转染 Elk1 siRNA（2.5μg/g）、MMP-9 siRNA（2.5μg/g）72h后,进行大潮气量机械通气。MV 4h组、MV 4h+si-Elk1组、MV 4h+si-MMP-9组的机械通气参数:潮气量Vr=20mL/kg,呼吸频率为40次/min,呼气末正压PEEP=0cm H2O,吸呼比I:E=1:2,机械通气时间为4h。大潮气量机械通气后,提取肺组织总蛋白,WB检测Elk1、MMP-9、TIMP-1的表达。结果1.体外实验:免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）检测发现,Input组中蛋白提取液中有Elk1和MMP-9两种蛋白,与CS 0h比较,CS 4h时Elk1和MMP-9两种蛋白表达升高;利用蛋白MMP-9进行沉淀,发现MMP-9被沉淀下来,同时Elk1也被沉淀下来,且沉淀下来的蛋白量随牵张的时间的增加而升高。WB检测发现,与CS 4h组比较,CS 4h+si-Elk1组中Elk1、MMP-9表达均降低（P＜0.05）;与CS 0h组比较,si-MMP-9组中MMP-9表达降低（P＜0.05）,Elk1表达差异无统计学意义（P＞0.05）;与CS 4h组比较,CS 4h+si-MMP-9组中MMP-9表达降低（P＜0.05）,Elk1表达差异无统计学意义（P＞0.05）。2.体内实验:WB检测发现,与MV4h组小鼠比较,MV4h+si-Elk1组小鼠肺组织Elk1、MMP-9表达降低（P＜0.05）;与MV 4h组小鼠比较,MV 4h+si-MMP-9组小鼠肺组织MMP-9表达降低（P＜0.05）,Elk1表达差异无统计学意义（P＞0.05）。WB检测发现,与MV Oh组小鼠比较,MV 4h组小鼠肺组织TIMP-1表达升高（P＜0.05）,MMP-9/TIMP-1比值升高（P＜0.05）;与MV 4h组小鼠比较,MV 4h+si-Elk1 组、MV 4h+si-MMP-9 组小鼠肺组织 TIMP-1 表达降低（P＜0.05）,MMP-9/TIMP-1 比值降低（P＜0.05）。结论机械通气相关肺损伤中Elk1和MMP-9存在相互作用,机械力牵张激活Elk1,介导MMP-9活化,MMP-9与生理性抑制剂TIMP-1失衡,MMP-9/TIMP-1比例升高。