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研究背景全球癌症的发病率居高不下,膀胱癌（bladder cancer,BC）作为泌尿男生殖系统最常见的肿瘤之一,按发病率的排名居第九位,每年全球有430000膀胱癌新诊断病例。得益于经济社会发展和基础医学及临床医学的整体发展,膀胱癌的治疗现状较前明显改善,但是膀胱癌的疾病进展及预后不良有多方面的原因,具体表现为癌细胞的快速增长及局部或者远处的器官转移、肿瘤对周围器官的浸润等。现阶段,膀胱癌的病因及发病机制尚未得到完全的阐明,如果能明确致病因素及疾病进展过程中的关键靶点位置及其通路传导,我能就可以针对这些重要因素施以精准的诊断和治疗。环状RNA（circRNAs）于上个世纪70年代被发现,但是起初被广大科学家认为是基因转录过程中的由于基因错误剪接而产生的,是一种无实际用途的分子,是作为一种“副产品”而存在,所以对环状RNA的研究和探索一直停滞不前。circRNAs是新定义的一种非编码RNA,它可以在转录和转录后水平调控基因的表达。自20世纪初以来,单分子测序技术蓬勃发展,同时也助推了生物信息学的进步,越来越多的研究表明,circRNAs在多种生物中都有广泛的表达,而且在不同物种、不同组织、不同生长阶段、不同细胞、不同细胞周期、不同疾病及发展阶段的表达具有差异性。而且已有诸多报道证实,部分环状RNA在不同肿瘤中发挥着至关重要的作用,如cricRNAs通过与miRNAs相互作用调节转录因子和经典及非经典信号通路促进肿瘤发展。现阶段,我们已经认识到非编码circRNA作为潜在的miRNA“海绵”的作用。与大多数线性RNA相比,circRNA没有3’末端,因此对核酸外切酶的降解更具抵抗力。circRNA的特征是高海绵容量（可以包含多个miRNA结合位点的序列）和相对较高的表达水平。这些特征表明,circRNA比线性非编码RNA更有效。circRNA“海绵”吸附效应具有miRNA和组织特异性的:某些circRNA仅影响特定家族在特定组织中的miRNA。circRNA调控基因的经典模式是circRNA-miRNA-mRNA。多项研究显示circRNA和膀胱癌的病理特征、预后和化疗敏感性有关,基础研究已经进一步确定膀胱癌中circRNAs的表达和多种生物功能有关。我们通过GEO数据库中膀胱癌cicrRNA芯片结果,搜索到膀胱癌相关的数据集（GSE97239）,筛选并发现了显著差异表达的hsacirc0130221（（注:来源于chr6:108,888,374-108,890,945,由亲本基因FOXO3的第2个外显子反向剪切成环构成,共有2571个核苷酸序列,命名为circFOXO3）。FOXO3是FOXO亚家族中的重要成员之一,FOXO3基因可同时编码环状RNAFOXO3（circFOXO3）和线性FOXO3（FOXO3mRNA）,与细胞凋亡、自噬等存在非常密切的联系。迄今为止,circFOXO3调节肿瘤进展的具体机制尚不清楚,在不同的肿瘤可表现为肿瘤抑制因子和肿瘤促进因子。既往研究表明,这种机制似乎多元化的。我们在本研究中将探索circFOXO3可能“海绵”吸附的miRNA及调控的靶基因。我们选取circFOXO3作为我们的研究对象,通过实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）分析技术,证实 circFOXO3在膀胱癌组织及细胞系中低表达。借助体外实验的方法,深度研究circFOXO3对膀胱癌细胞的生物学影响,进而探索与开发其产生生物学作用的机制。实验方法1.circFOXO3在临床组织和细胞系水平的表达情况及生物学意义1.1选取病理类型为膀胱尿路上皮癌的标本及癌旁2cm正常膀胱组织,共计49对,分别提取RNA,运用qRT-PCR分别检测膀胱癌组织和癌旁正常组织中circFOXO3的表达水平。收集膀胱癌病人的临床资料,并列表分析膀胱癌病人的临床特点。依据病患circFOXO3指标,将样本划分成高、低表达组,应用Kaplan-Meier生存分析,检验两组终点（生存期或生存率）的差异有无显著性。1.2应用qRT-PCR分别检测人膀胱癌细胞系5637、人膀胱癌细胞系EJ、人源肺转移性膀胱癌细胞T24、人膀胱移行细胞癌细胞UM-UC-3、膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1中circFOXO3的表达水平。体外实验分别对膀胱癌细胞系EJ和T24过表达circFOXO3,观察膀胱癌细胞的生物学变化。应用CCK-8（细胞计数试剂盒-8）检测膀胱癌细胞增殖情况,Transwe1l检测膀胱癌细胞迁移和侵袭能力。2.膀胱癌细胞中存在circFOXO3/miR-9-5p/TGFBR2调控轴2.1利用生物信息学分析数据库及软件TargetScan、miRanda和Circbase预测CircFOXO3可能结合吸附的miRNA及其调控的靶基因。2.2过表达circFOXO3载体转染EJ和T24细胞,运用qRT-PCR检测miR-9-5p指标的变化。2.3利用人工合成的miR-9-5p mimics转染EJ和T24细胞,RT-PCR检测circFOXO3的表达水平;荧光素酶报告基因实验检测circFOXO3WT报告质粒或Mut报告质粒的荧光素酶活性以验证miR-9-5p与circFOXO3和TGFBR2的互作。2.4为验证circFOXO3对TGFBR2的调控作用,同时干扰circFOXO3和TGFBR2,qRT-PCR 和 Western blot 检测TGFBR2 mRNA和蛋白的表达。3.circFOXO3通过circFOXO3/miR-9-5p/TGFBR2调控轴抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭3.1 qRT-PCR检测膀胱癌组织和邻近正常组织中的TGFBR2的表达水平。3.2 在膀胱癌细胞 EJ 和 T24 中转染 circFOXO3 ctrl vector、circFOXO3 过表达载体、circFOXO3过表达载体和siTGFBR2,CCK8检测各组膀胱癌细胞EJ和T24增殖情况,Transwell检测各组膀胱细胞系EJ和T24的迁移和侵袭情况。实验结果1.circFOXO3在膀胱癌组织和细胞系水平的表达情况及生物学意义1.1 qRT-PCR结FOXO3显示circFOXO3在膀胱癌组织中的表达水平比癌旁正常膀胱组织的表达水平低,相对表达量分别为1.36±0.53和3.81±0.62,统计学分析显示具有显著性差异（P＜0.05）;Kaplan-Meier test生存分析结FOXO3显示circFOXO3表达水平较低的患者,其总生存时间（Overall survival,OS）相对于水平较高者短;circFOXO3低表达组中位生存期（Median Survival Time）为27.8个月（P＜0.05）。膀胱癌患者的总生存时间与circFOXO3表达呈负相关。circFOXO3的表达水平和病人的年龄、性别等临床参数无统计学差异,和膀胱癌的病理T分期以及淋巴结转移呈现正相关。1.2 circFOXO3在人膀胱癌细胞系5637、人膀胱癌细胞系EJ、人源肺转移性膀胱癌细胞T24、人膀胱移行细胞癌细胞UM-UC-3、膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1 中相对表达量分别为:1.03±0.17、0.69±0.08、0.65±0.93、0.33±0.03、0.27±0.04,P＜0.05）。circFOXO3 的表达水平 EJ、T24 低表达程度高,我们选取其作为后续研究的细胞系;CCK8结果显示过表达circFOXO3可抑制T24细胞和EJ细胞的增殖能力。Transwell实验结果表明上调circFOXO3的表达可抑制T24细胞和EJ细胞的迁移和侵袭能力。2.膀胱癌细胞中存在circFOXO3/miR-9-5p/TGFBR2调控轴2.1利用生物信息学分析数据库Cirbase、TargetScan和miRanda预测circFOXO3可能海绵结合的miRNA及调控的靶基因。发现miR-9-5p可能成为进一步研究的潜在候选者。然后,我们在miR-9-5p下游基因TGFBR2上找到了可能受miR-9-5p调节的潜在结合位点。2.2 qRT-PCR显示上调circFOXO3表达后miR-9-5p的表达水平降低。2.3双荧光素酶基因水平检测报告显示,circFOXO3 WT和miR-9-5p过表达载体的BC细胞比具有circFOXO3突变体和miR-9-5p过表达载体的细胞具有更低的荧光素酶水平,TGFBR2 WT和miR-9-5p表达载体的BC细胞比具有TGFBR2突变体和miR-9-5p表达载体的细胞具有更低的荧光素酶水平,证实miR-9-5p可与 circFOXO3 和 TGFBR2 互作。2.4 RNA干扰实验中,qRT-PCR结果显示在EJ和T24细胞系中circFOXO3过表达和siTGFBR2共转染组的TGFBR2 mRNA表达水平比单独circFOXO3过表达组低,而circFOXO3过表达、siTGFBR2和TGFBR2过表达共转染组的TGFBR2 mRNA表达水平高于circFOXO3过表达和siTGFBR2共转染组,但是低于过表达circFOXO3组。Western blot结果显示在EJ和T24细胞系中过表达circFOXO3和siTGFBR2共转染组的TGFBR2的蛋白表达水平比单独circFOXO3过表达组低,而circFOXO3过表达、siTGFBR2和TGFBR2过表达共转染组的TGFBR2蛋白表达水平高于circFOXO3过表达和siTGFBR2共转染组,但是低于circFOXO3过表达组。所以,qRT-PCR和Western blot显示circFOXO3可以调控TGFBR2的转录和翻译表达水平。3.circFOXO3通过circFOXO3/miR-9-5p/TGFBR2调控轴抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭3.1 qRT-PCR结果显示,与正常组织相比,膀胱癌组织中TGFBR2的mRNA表达水平显著降低。3.2 CCK8分析表明,上调circFOXO3表达能够抑制EJ和T24细胞的增殖,而TGFBR2siRNA减弱了这种抑制效果。3.3 Transwell分析表明,circFOXO3过表达抑制了 EJ和T24细胞迁移和侵袭能力,与仅circFOXO3表达载体转染组相比,circFOXO3过表达载体和TGFBR2 siRNA共转染的膀胱癌细胞具有更大的迁移和侵袭能力。结论1.膀胱癌组织中及膀胱癌细胞中circFOXO3的表达较正常尿路上皮组织下调。膀胱癌病人中circFOXO3的低表达与更晚的临床分期、更高的病理分级、远处转移和更差的预后相关。circFOXO3作为抑癌因子,可能在膀胱癌的发生发展中扮演了重要角色,为寻找膀胱癌的血浆靶标,提供了新的重要理论依据。2.circFOXO3调控膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力可能是通过miR-9-5p/TGFBR2通路完成的,为膀胱癌新的治疗靶点提供理论依据。