羟基红花黄色素A干预人骨髓间充质干细胞成骨分化的组蛋白修饰研究

• 作 者: 王鹏
• 机 构: 广州中医药大学
• 出 处: 广州中医药大学
• 发表日期: 2020年期
• 关键词: 羟基红花黄色素A

目的：
　　观察中药红花活性单体之一羟基红花黄色素A(HSYA)对成人骨髓间充干细胞成骨分化影响的表观遗传机制，为祛瘀法预防骨质疏松症提供理论支持和实验依据。
　　方法：
　　1.人骨髓间充质干细胞系培养于ɑ-MEM完全培养基中,体外扩增,传至第4代(P4)拍摄显微电镜图片评估细胞生长状态；2.利用细胞计数试剂盒(CCK-8)，检验各不同浓度羟基红花黄色素A(HSYA)干预成人骨髓间充质干细胞24/48/72h后对细胞生存能力的影响；3.对细胞进行成骨诱导分化培养，并加予羟基红花黄色素A药物干预，诱导7天后各组行碱性磷酸酶(ALP)染色；4.蛋白质免疫印迹法检测经单纯成骨诱导分化培养及各浓度羟基红花黄色素A药物干预7天后成人骨髓间充质干细胞中β-catenin、Runx2相关成骨分化蛋白水平；5.收集经药物干预后的细胞与对照组细胞，进行转录组测序(RNA-sequencing)，与对照组细胞相比，发现药物干预组中有差异表达水平的基因，选取感兴趣的靶点基因与信号分子行实时荧光定量PCR功能验证；6.对靶点基因行小干扰RNA(siRNA)干扰技术降低其表达，蛋白质免疫印迹法检测经siRNA干扰靶点基因后该组细胞中β-catenin、osterix相关成骨分化蛋白水平。7.细胞免疫荧光检测经药物干预48h后二甲基化标记H3K9m2和H3K27m2蛋白表达情况。8.建立去卵巢骨质疏松大鼠模型，腹腔注射HSYA水溶液，进一步探究HSYA在体内防治骨质疏松症的作用效果。
　　结果：
　　1.体外培养的细胞增殖能力活跃，生长形态良好；2.HSYA各浓度(1、10、20、40umol)对hBMSCs的生存增殖能力均无显著影响。3.碱性磷酸酶染色实验显示与单纯成骨诱导分化组对比，HSYA有良好的促进hBMSCs成骨分化的作用；4.蛋白质免疫印迹结果示HSYA可上调hBMSCs中成骨相关标志物(β-catenin、Runx2)的表达水平。5.转录组测序结果显示组蛋白JmjC家族去甲基化酶、和基质金属蛋白(MMP)家族、SCX转录因子等骨与软组织相关信号分子在药物干预组中有差异表达，进一步实时荧光定量PCR结果显示KDM7A基因表达水平相较与对照组在各药物干预组中均有不同程度升高。6.蛋白质免疫印迹结果显示干扰KDM7A基因表达可影响成人骨髓间充干细胞成骨分化。7.HSYA可显著抑制二甲基化标记H3K9m2和H3K27m2蛋白在细胞核内的表达。8.Micro-Ct分析显示，在去卵巢骨质疏松大鼠模型中，三维呈像、组织形态学证实药物组可抑制过度骨丢失，其中以2.5mg/kg药物剂量为最佳浓度。
　　结论：
　　中药红花单体之一羟基红花黄色素A(HSYA)可促进成人骨髓间充干细胞成骨分化，并且表观遗传中的组蛋白甲基化修饰也参与其作用的发生发展。