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肝细胞癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)是全球范围内最为常见的恶性肿瘤之一，每年发病约26万例(占恶性肿瘤的4％)，尤高发于非洲东南部和东南亚，我国多见于东南沿海。HCC一经确诊，5年存活率不到10％。平均每年我国约有11万人死于HCC，对人类健康造成极大的威胁。因此如何能早期确诊并治疗HCC一直来是国内外众多学者研究的热点。
越来越多学者认为HCC是基因病，必须从探明HCC发病的分子机制入手才能从根本上控制HCC的发生和发展。随着分子生物学的发展，对HCC发病机制的认识有了飞跃的进步。目前普遍认为HCC的发生和发展是一个多步骤逐渐演变的复杂过程，涉及多组基因结构和表达水平的变化，包括原癌基因的激活和肿瘤抑制基因的失活等改变。
追溯肿瘤抑制基因失活的内在原因，除基因DNA突变外，还与基因的甲基化、等位基因的杂合性丢失(LOH)、基因的转录抑制(如反义抑制)等有关。其中基因启动子甲基化是肿瘤抑制基因转录静息的主要原因，能在转录水平抑制基因的表达，因而在肿瘤起因中有重要的作用。
DNA的甲基化修饰通常是发生在5-CpG-3’序列上，常位于基因的启动子区。目前研究发现许多肿瘤抑制基因启动子区存在甲基化，常见的有(1)RB1途径相关基因，包括p16、p15、RB1、CDK4和CyclinD1等基因；(2)p53途径相关基因，包括p53、p14和mdm2基因。
DNA甲基化是一种影响基因表达的机制，只引起基因表达异常，并不改变DNA本身的序列和基因产物，所以这种改变是可逆的。因此，运用甲基化抑制剂使甲基化的肿瘤抑制基因去甲基化，重新发挥抑制肿瘤的功能，就有可能成为一种新的肿瘤治疗途径。常见的甲基化抑制剂是胞苷类似物如5-杂氮-2-脱氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine，5Aza-dc)，其作用机制是与DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase，DNMT)共价结合，降低酶的生物活性。许多研究者成功地将5Aza-dc运用在多个体外培养的肿瘤细胞株中，逆转了多个肿瘤抑制基因启动子的甲基化状态，使不同的肿瘤抑制基因得以开放，进而有效地抑制了肿瘤的发展。
目前用于DNA甲基化检测的方法很多，有高效液相色谱法(Highperformanceliquidchromatography，HPLC)、甲基化特异性PCR(methylation-specificPCR，MSP)、基因测序、甲基化敏感性内切酶指纹法(Methylation-SensitiveRestrictionFingerprinting，MSRF)和细胞去甲基化培养等方法。这些方法分别能研究单一基因的甲基化及筛选肿瘤相关的异常甲基化基因。
本文的目的在于筛选HCC相关的异常甲基化基因，并研究该基因异常甲基化在HCC发生情况，再通过探讨启动子甲基化对基因表达的影响进而分析肿瘤抑制基因静息的机制，为阐明HCC的发生、发展机制提供研究基础。全文共分为四个部分：
一、运用MSRF技术筛选肝细胞癌中异常甲基化基因收集32例新鲜HCC组织，包括肿瘤组织及瘤旁5cm以外的肝组织，并收集6例血管瘤或胆管结石旁正常肝组织，提取组织DNA，经过甲基化非敏感性内切酶MseⅠ单独消化或MseⅠ和甲基化敏感的内切酶BstUⅠ联合消化DNA，产物分别经过2对随机引物(Bs1/18，Bs12/13)PCR扩增，电泳显示HCC癌组织与癌旁肝组织及正常肝组织相比有3条异常甲基化片段，长度分别为200bp、210bp及300bp左右。其中200bp异常甲基化片段出现于3例病例中，210bp及300bp异常甲基化出现于另外2例病例中。通过回收该异常甲基化片段，与T载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，选取阳性克隆测序，将获取的序列与人类基因文库进行类比分析，发现这3条异常甲基化片段分别与ZHX2(Zincfingersandhomeoboxesprotein2)、MEF2C(myocyteenhancerfactor2C，MADSboxtranscriptionenhancerpolypeptideC)及p16基因启动子区存在高度同源性。
二、肝细胞癌中ZHX2启动子甲基化的检测将能筛选到ZHX2启动子异常甲基化的3例HCC癌组织及6例正常肝组织DNA，经过亚硫酸盐修饰后，测序引物扩增，产物亚克隆于大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆测序，结果显示此3例HCC癌组织中ZHX2基因启动子区多个CG二核苷酸序列存在甲基化，而正常肝组织则无。使用MSP检测32例HCC癌、癌旁肝组织和6例正常肝组织中ZHX2基因启动子甲基化的发生情况，发现在正常肝组织未检测到甲基化，32例癌旁肝组织中仅有5例存在甲基化(15.6％)，而32例HCC癌组织中有15例(46.9％)存在甲基化，这15例存在甲基化的患者其血清甲胎球蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)值均≥25ng/mL，而血清AFP＜25ng/mL者则未检测到甲基化；19例低级别HCC中有9例(47.4％)发现存在甲基化，而13例高级别HCC中有6例(6/13，46.2％)可检测到甲基化，两者差异无显著性(P＞0.05)；10例伴随转移的HCC中8例检测到甲基化，高于无转移组(7/22，31.8％)。
三、肝细胞癌中ZHX2基因mRNA与蛋白的表达使用RT-PCR检测32例HCC癌组织及其癌旁肝组织、6例正常肝组织中ZHX2mRNA扩增情况，结果显示6例正常肝组织中均可检测到ZHX2mRNA的扩增，32例癌旁肝组织中20例(62.5％)能检测到ZHX2mRNA扩增，明显高于HCC癌组织(11/32，34.4％)。19例低级别HCC中有7例(36.8％)呈阳性扩增，13例高级别HCC中有4例(30.1％)呈阳性扩增，两者差异无显著性(P＞0.05)。血清AFP≥25ng/mL的26例HCC中6(23.1％)例呈阳性扩增，AFP＜25ng/mL的6例HCC中5例(83.3％)呈阳性扩增，两者差异有显著性(P＜0.05)。10例术中发现转移的HCC癌组织中均未见mRNA扩增，明显低于无转移组(11/22，50.0％，P＜0.05)。15例存在ZHX2启动子甲基化的HCC中仅有2例能检测到ZHX2mRNA扩增，而17例无甲基化的HCC中有8例能检测到mRNA的扩增，甲基化发生率与mRNA扩增呈负相关。WesternBlot检测结果显示32例HCC癌组织中有6例能检测到ZHX2蛋白的表达，明显低于癌旁肝组织(14/32，43.8％)及正常肝组织(4/6，66.7％，P＜0.05)，阳性组织均为mRNA呈阳性扩增者。15例存在ZHX2基因启动子甲基化的HCC中未检测到ZHX2蛋白表达，17例无甲基化的HCC中有6例能检测到ZHX2蛋白表达。使用免疫组织化学检测HCC组织芯片中ZHX2蛋白的表达情况，结果显示140例HCC癌组织中有21例(15.0％)呈阳性表达，明显低于癌旁肝组织(49/140，35.0％)。伴随转移的60例HCC中4例(6.7％)呈阳性表达，明显低于无转移组(17/80，21.3％)。
四、5Aza-dc逆转肝癌细胞株ZHX2基因启动子甲基化使用不同浓度的去甲基化药物5Aza-dc培养肝癌细胞株HepG2，采用MSP检测药物处理前后的细胞ZHX2基因启动子甲基化改变情况，结果显示HepG2肝癌细胞株存在ZHX2基因启动子甲基化，但能被5Aza-dc逆转。RT-PCR检测结果显示HepG2可见少量ZHX2mRNA扩增，药物处理后其mRNA扩增水平明显增加。WesternBlot未能检测到细胞有ZHX2蛋白表达，去甲基化药物处理后，可见微量ZHX2蛋白表达。流式细胞检测结果显示与对照组相比，药物处理组G0/G1期细胞增多，G2/M期细胞减少，凋亡率则无明显改变。
综上所述，我们得出以下结论：(1)甲基化敏感性内切酶指纹法可用于筛选HCC相关的异常甲基化基因；(2)HCC中存在ZHX2基因启动子甲基化，正常肝组织中则无，该甲基化是肿瘤相关性的；(3)ZHX2mRNA及蛋白表达在HCC中明显减少，尤其在伴随转移和血清AFP值≥25ng/mL的病例中，启动子甲基化是该基因静息的主要机制之一；(4)ZHX2基因可被认为是一新的肿瘤抑制基因；(5)5Aza-dc能逆转ZHX2基因启动子甲基化状态，增加ZHX2基因mRNA和蛋白表达，并能改变细胞周期时相分布。