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Varp是Rab21的一种鸟苷酸转换因子（GEF）。研究表明Varp在囊泡运输和内吞体转运过程中发挥着重要的调控作用。细胞自噬是进化过程中高度保守的一类细胞行为。细胞在营养匮乏情况下通过自噬降解胞内大分子物质为自身存活和生长提供营养和能量。细胞内存在众多蛋白因子对自噬进行调节，但目前关于Varp在自噬中的作用仍然未知。本实验利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Varp敲除的HeLa细胞系，在细胞水平上探究Varp功能缺失对细胞自噬的影响，并分析其潜在的调控机制。
本实验中我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建Varp敲除的HeLa细胞系。并通过蛋白免疫印迹实验（Western-Blot）和蛋白免疫荧光染色实验（IF）检测细胞中自噬标记蛋白LC3-Ⅱ的蛋白水平变化。随后我们利用免疫荧光染色实验对Varp和LC3以及Varp与LAMP1进行共定位分析，探究Varp在自噬体和溶酶体上的定位情况。为了进一步探究Varp敲除对自噬体和溶酶体融合的影响，我们将编码GFP-RFP-LC3的慢病毒质粒转导到WT细胞和KO细胞，观察细胞内自噬体和溶酶体的融合情况。STX17是自噬体和溶酶体融合过程中的一种重要调控蛋白，我们通过蛋白免疫共沉淀实验（CO-IP）探究Varp与 STX17的相互作用情况。
蛋白免疫印迹实验和免疫荧光染色实验结果均表明 Varp 敲除导致细胞内的LC3-Ⅱ的蛋白水平显著增加。揭示了Varp敲除影响细胞内的自噬过程。在用CQ处理细胞后，KO细胞中的LC3-Ⅱ水平与WT相比没有明显变化，说明Varp敲除引起LC3-Ⅱ蛋白水平增加很大程度上是抑制了LC3-Ⅱ的降解过程。Varp和LC3/LAMP1的免疫共定位实验结果表明Varp和LC3/LAMP1均存在共定位情况，说明Varp在自噬体和溶酶体上均有分布。随后我们采用GFP-RFP-LC3的自噬双荧光系统检测细胞内自噬通路情况，发现在氨基酸饥饿培养激活自噬后，KO细胞内自噬体和溶酶体的融合减少。揭示了Varp敲除抑制自噬体和溶酶体的融合。同时CO-IP实验表明Varp与STX17存在相互作用。
综上，我们发现Varp敲除导致细胞内的LC3-Ⅱ蛋白含量增加，且LC3-Ⅱ蛋白水平的增加是由于LC3-Ⅱ的降解减少导致。同时Varp在自噬体和溶酶体上的定位，及GFP-RFP-LC3实验表明Varp极有可能通过STX17促进自噬过程中自噬体和溶酶体的融合过程。
本实验中我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建Varp敲除的HeLa细胞系。并通过蛋白免疫印迹实验（Western-Blot）和蛋白免疫荧光染色实验（IF）检测细胞中自噬标记蛋白LC3-Ⅱ的蛋白水平变化。随后我们利用免疫荧光染色实验对Varp和LC3以及Varp与LAMP1进行共定位分析，探究Varp在自噬体和溶酶体上的定位情况。为了进一步探究Varp敲除对自噬体和溶酶体融合的影响，我们将编码GFP-RFP-LC3的慢病毒质粒转导到WT细胞和KO细胞，观察细胞内自噬体和溶酶体的融合情况。STX17是自噬体和溶酶体融合过程中的一种重要调控蛋白，我们通过蛋白免疫共沉淀实验（CO-IP）探究Varp与 STX17的相互作用情况。
蛋白免疫印迹实验和免疫荧光染色实验结果均表明 Varp 敲除导致细胞内的LC3-Ⅱ的蛋白水平显著增加。揭示了Varp敲除影响细胞内的自噬过程。在用CQ处理细胞后，KO细胞中的LC3-Ⅱ水平与WT相比没有明显变化，说明Varp敲除引起LC3-Ⅱ蛋白水平增加很大程度上是抑制了LC3-Ⅱ的降解过程。Varp和LC3/LAMP1的免疫共定位实验结果表明Varp和LC3/LAMP1均存在共定位情况，说明Varp在自噬体和溶酶体上均有分布。随后我们采用GFP-RFP-LC3的自噬双荧光系统检测细胞内自噬通路情况，发现在氨基酸饥饿培养激活自噬后，KO细胞内自噬体和溶酶体的融合减少。揭示了Varp敲除抑制自噬体和溶酶体的融合。同时CO-IP实验表明Varp与STX17存在相互作用。
综上，我们发现Varp敲除导致细胞内的LC3-Ⅱ蛋白含量增加，且LC3-Ⅱ蛋白水平的增加是由于LC3-Ⅱ的降解减少导致。同时Varp在自噬体和溶酶体上的定位，及GFP-RFP-LC3实验表明Varp极有可能通过STX17促进自噬过程中自噬体和溶酶体的融合过程。