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本研究旨在在诱导大鼠结肠上皮表达PepTl的基础上，检测结肠PepTl的短肽转运功能，并进一步探讨PepTl介导的fMLP对结肠的炎性损伤的可能性，以探讨短肽载体PepTl在结肠炎性损伤中的作用。另外根据pH值改变可调控PepTl的短肽转运功能的原理，在体外和体内实验中探讨了pH值降低增强PepTl的转运能力后，最终影响fMLP对大鼠结肠损伤的可能性。这些研究目的在于探讨结肠异常表达的PepTl介导结肠主要细菌产物导致肠上皮损伤的可能性，以为今后研究临床病理状况下结肠损伤的机制提供依据。
1、肠切除诱导大鼠结肠上皮PepTl的表达及检测
本研究采用小肠切除的方法诱导结肠上皮表达短肽载体PepTl。雄性Sprague—Dawley大鼠，体重240-270g，分为两组：1) 诱导组(80％小肠切除)2)对照组(小肠横断并重新吻合)。诱导组手术：切除大鼠Treitz韧带至回盲瓣之间80％小肠，保留相同长度的近段空肠和远段结肠及其血管弓。对照组手术(小肠横断并重新吻合)：Treitz韧带至回盲瓣之间小肠中段横断，两侧重新吻合。
本研究采用Western Blot和RT—PCR半定量分析结肠PepT1的蛋白表达和转录活性，并用免疫组化的方法检测PepT1的表达部位和表达强度。在此之前根据大鼠PepT1基因序列合成相对应其序列693-710的18个氨基酸多肽的免疫抗原，通过1次基础免疫和3次加强免疫，取血后制备了兔抗PepT1抗体。研究发现小肠切除可以诱导大鼠结肠大量表达PepT1，免疫组化显示诱导组大鼠结肠上皮刷状缘PepT1呈阳性表达，而在对照组大鼠结肠上皮PepT1不表达。Western Blot和RT—PCR检测发现诱导组的结肠PepTl表达在术后2周达高峰，术后2周(n=6)结肠PepT1蛋白达高峰，最高可达到对照组大鼠小肠PepT1表达水平的50％，3周(n=5)下降，到第4周(n=5)已降至第2周水平的25％。而对照组术后第2周(n=6)、3周(n=5)和4周(n=5)大鼠的结肠粘膜组织未发现PepT1表达。
2、结肠上皮PepT1功能的测定
本研究采用活体大鼠结肠cephalexin(PepT1底物)灌注技术和动脉血cephalexin高效液相色谱分析方法，测定诱导组大鼠结肠短肽吸收功能。结果显示相对于对照组大鼠，表达PepT1的大鼠结肠上皮(诱导组)具备了很强的短肽的吸收能力。结肠灌注cephalexin 15、30、45、60分钟后，诱导组大鼠动脉cephalexin血浓度是对照组大鼠的5-7倍(P＜0.005)。根据PepT1的竞争性抑制机制，用Gly—Gly抑制PepTl功能后，cephalexin自结肠吸收减少了70-80％(P=0.002)。进一步分析PepT1的蛋白表达水平与大鼠动脉血cephalexin浓度的关系后发现，诱导组大鼠结肠上皮对cephalexin的吸收与结肠上皮PepT1蛋白表达水平呈显著正相关性(Pearson关系数为r=0.868，P＜0.01)。
3、PepTl对fMLP的转运及其动力学特征研究
旨在探讨诱导组大鼠结肠上皮是否具有fMLP转运能力以及这种转运是否由结肠异常表达的PepTl介导的。由于避免了fMLP对肠道的损伤及体内神经内分泌诸因素对实验的干扰，肠粘膜刷状缘膜囊(Brush Border Member Vehicle，BBMV)是探讨PepTl转运炎性介质fMLP功能的良好工具。本研究证实诱导组大鼠结肠上皮BBMV摄取细菌三肽产物fMLP的能力与对照组相比显著增强。200 μl含50 μM fMLP的缓冲液与20 μl BBMV孵育后10分钟内，诱导组2周大鼠BBMV摄取fMLP浓度是对照组BBMV摄取的7～10倍(P＜0.05)；诱导组4周BBMV摄取fMLP浓度是对照组的3～5倍。诱导组大鼠结肠BBMV转运fMLP的动力学特征符合Michaelis—Menten方程，诱导组4周和2周相比，结肠BBMV摄取fMLP的亲合指数Km值差异无显著性[10.93±2.67vs．12.24±3.17mM，P＞0.05]，这显示fMLP在结肠BBMV的转运中由一个恒定的转运系统来完成；而诱导组4周较诱导组2周的最大摄取速度Vm明显降低[3.51±0.65 vs．7.71±0.84nmol/mg protein/30s，P＜0.01]，这提示转运fMLP的载体数量减少，这已被WesternBlot、RT-PCR．及免疫组化结果所证实。该结果表明随着结肠上皮PepTl的水平下降，BBMV摄取fMLP的速度随之下降。进一步研究证实，PepTl被竞争性抑制后，结肠BBMV摄取fMLP的能力显著下降。将诱导组2周和4周的结肠BBMV分别与50μMfMLP、50μ MfMLP+5mM Gly—Gly和50 μMfMLP+5mM glycine混合孵育，则无论在诱导组2周和4周中，均发现结肠BBMV摄取fMLP的速度在50 μMfMLP+5mM Gly-Gly组较单独50 μM fMLP组明显降低；与此对照，50 μMfMLP+5 mM Gly(非PepTl底物)则并不影响这两组BBMV对fMLP的摄取。由于PepTl的底物竞争性抑制fMLP的转运，这表明PepTl是fMLP在结肠BBMV的摄取中的主要途径。
4、PepT1介导的fMLP对结肠上皮损伤
本研究旨在研究fMLP能否在PepT1的介导下引发大鼠结肠上皮的炎性损伤。利用fMLP结肠灌注实验，结合病理学检查和结肠组织髓过氧化物酶(MPO)活性的测定，检测了fMLP对诱导组和对照组大鼠结肠上皮造成的炎性损伤；同时利用PepT1竞争性抑制原理，观察Gly—Gly抑制PepT1功能后，fMLP对结肠的损伤程度的改变，探讨了PepT1在fMLP引发的结肠损伤中的作用。根据肠切除术后结肠上皮PepT1逐渐衰减的特点，分别对术后2周大鼠(结肠PepT1高表达)及术后4周(结肠PepT1低表达)进行fMLP结肠灌注，各自与假手术组(小肠切断吻合)对照。结果发现10μMfMLP可引发诱导组2周(PepT1高表达)结肠组织明显损伤并导致结肠组织MPO升高70％[38.4±3.2(n=4)vs 66.4±7.5(n=5)，P＜0.01]，对照组大鼠结肠组织则未见损伤；而10μMfMLP不能使诱导组术后4周(PepT1低表达)大鼠结肠明显损伤，MPO活性无明显升高。抑制PepT1功能后，由10μM fMLP引发的MPO活性显著下降(76.5±9.2(n=6)vs．48.2±5.5(n=6)IU/g，P＜0.01)，fMLP对结肠的损伤被抑制。
5、通过pH值调控PepT1功能影响fMLP介导的大鼠结肠损伤
本研究旨在探讨PepT1功能的变化对fMLP引发的大鼠结肠损伤的影响。离体和在体的实验研究均表明，H+内流是PepT1转运的驱动力。本研究首先通过结肠刷状缘囊泡(BBMV)探讨pH值改变对结肠PepT1摄取fMLP功能的影响。在诱导组4周大鼠结肠BBMV中，自外向内的H+浓度梯度增加(pH值降低)明显提高了BBMV对fMLP的摄取能力。存在自外向内的H+浓度梯度时(pH6.0)与不存在H+浓度梯度(pH7.5)相比，前2分钟摄取速度陡然增加，提高幅度前者是后者的1倍左右，此后摄取fMLP的速度的增加幅度减少，10分钟后结肠BBMV摄取的fMLP浓度升高60％。Gly—Gly竞争性抑制PepT1功能后，在pH6.0和pH7.5组(存在和不存在H+浓度梯度)中，结肠BBMV对fMLP的摄取均被显著抑制，而作为对照，Gly并不影响pH7.5和pH6.0组的BBMV的摄取速度，这提示H+浓度梯度影响结肠BBMV对fMLP的摄取是通过调控短肽载体PepTl的转运功能来实现的。活体实验证实，诱导组4周大鼠结肠分别灌注pH 7.5和pH 6.0的10μ M fMLP的缓冲液4小时后，pH 7.5 fMLP组结肠组织未见损伤，MPO活性无显著升高，而pH 6.0 fMLP组大鼠结肠组织明显炎性损伤，结肠组织MPO活性较pH 7.5组升高53％。pH 6.0的不含fMLP的缓冲液对结肠组织并未造成损伤。