论文部分内容阅读
酸敏感离子通道(ASICs)是一类质子门控的非选择性阳离子通道，它们是中枢神经系统以及外周神经系统中感知胞外酸化最为敏感的离子通道，属于上皮钠通道/退化蛋白超家族。截止目前为止，已经发现四个基因至少编码六个亚基(ASIC1a，ASIC1b，ASIC2a，ASIC2b,ASIC3和ASIC4)。大多数ASICs所介导的电流失活很快，但是，主要分布于外周感觉神经元上的酸敏感离子通道亚型3(ASIC3)被胞外酸化激活后，有一个明显的平台电流。而且，已有的研究表明这个平台电流在关节炎、心肌缺血以及炎症等病理过程中具有重作用。因此，ASIC3似乎是一个治疗由于胞外酸化(心绞痛、炎症痛等)引起的疼痛很有前景的治疗靶点。 组织酸化和炎症因子在炎症痛的感知过程中发挥重要作用。但是，有关质子、炎症因子以及ASICs之间的相互作用目前还不是很清楚。利用外源表达系统和急性分离得到的DRG神经元，我们研究了炎症因子对ASIC3的调控作用，发现五羟色胺能够剂量依赖地增加ASIC3、ASIC3/1a和ASIC3/1b的平台开放电流。在机制上，发现五羟色胺的这种增强作用是直接与酸敏感离子通道本身相互作用的，而不是通过五羟色胺受体，因为五羟色胺受体阻断剂(Y-25130和二甲麦角新碱)并不能阻断这种增强作用。我们发现非质子感受域上关键残基(E79或者E423)的突变能够完全阻断五羟色胺的这种增强作用。同时，在放射性受体亲和实验中发现，非质子感受域上关键残基(ASIC3-E423A)的突变能够显著降低五羟色胺的结合。另外我们通过筛选化合物库的方法发现一个外源的小分子S-[(2-胍基-4-噻唑)甲基]异硫脲(SGI)也能够剂量依赖地增强ASIC3的持续性开放，其作用机制与五羟色胺相似。五羟色胺增强ASIC3的平台开放足以增加神经元的兴奋性。在体注射五羟色胺和酸溶液(或者SGI和酸溶液)能够诱导野生型小鼠产生明显的疼痛行为，但是这种疼痛行为的诱导依赖ASIC3通道的存在，因为在ASIC3敲除小鼠上，这种疼痛行为明显减弱。但是，ASIC1a敲除并不影响五羟色胺对酸诱导的疼痛行为的敏化。并且SGI也能够产生上述类似五羟色胺的作用。总之，我们的实验结果表明炎症因子五羟色胺能够增强ASIC3同聚和ASIC3/1a和ASIC3/1b异聚体的平台开放，从而参与炎症痛觉调控。同时，我们的结果也提示ASIC3可以作为一种同时探测胞外多种因子刺激的感受器，比如质子和五羟色胺。我们的实验结果再次强调ASIC3通道在炎症痛过程中具有非常重要的作用，为ASIC3通道成为新的炎症痛治疗靶点提供了理论支持。 ASIC3的持续开放相电流对酸化诱导的痛觉感受以及疼痛信号的整合有很重要的作用，但是ASIC3持续性开放的结构基础至今仍然不是很清楚。天然多肽FMRF-酰胺能够非常显著地增强ASIC3的持续开放相电流，在这项研究中，我们以FMRF-NH2为探针来研究ASIC3平台开放的结构基础。综合利用定点突变，电生理记录，共价修饰，双重突变体周期分析和计算机分子模拟分析等技术手段，我们发现位于胞外域三个亚基界面处的相互作用复合体E423-E79-Q269-Q271(EEQQ)对于持续酸化诱导的的ASIC3的持续开放是至关重要的。突变或者共价修饰该复合体中任意一个氨基酸都会导致ASIC3平台电流加大，这表明EEQQ模块在调节ASIC3的重要性。借助于分子动力学模拟和简正模态分析，我们发现EEQQ模块作为一个开关元件来控制β-linker motif与“指形”结构域(finger domain)结合和解离，从而调控ASIC3的的脱敏和平台电流。因此，我们鉴定得到EEQQ模块和其关键的偶联模块在调控ASIC3持续开放过程中的重要构像转变机制。这种独特的调控ASIC3持续开放的变构调节机制将有助于我们理解ASIC的门控机制以及基于构效关系研究来设计和开发新型的镇痛药物。另外，成功鉴定参与ASIC通道持续开放的模块域以及关键的残基，借助于遗传学的方法，将有助于发现在生理或者病理条件下ASIC通道持续开放的新功能。