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植物由于不能移动，在它们与植食性昆虫的长期“斗争”过程中，进化出了一种通过释放挥发性有机化合物(VOC)以吸引害虫天敌的间接防御方式应对害虫。萜烯同系物(E)-4，8-二甲基-1，3，7-壬三烯(DMNT)和(E，E)-4，8，12-三甲基-1，3，7，11-十三碳四烯(TMTT)是在植物中分布最为广泛的挥发物之一，它们从害虫取食的叶片中释放出来并吸引害虫的天敌，在植物保护方面起着重要的作用。本研究围绕着这两种萜烯同系物进行，主要分为三部分：第一部分利用转基因技术将4个外源萜烯同系物代谢途径中的基因(AtCYP82G1*、PlCYP、PlTPS3和PlTPS4)单独或按照TPS+CYP组合形式两两聚合转入水稻中。由于萜烯同系物的合成主要受限于其前体萜类物质的供给，而萜类物质的含量又由其直接前体物质(GPP，FPP，GGPP)含量决定，故将PlTPS4基因5’末端加上叶绿体定位信号肽编码序列(ctp)和线粒体定位信号肽序列(mtp)转入水稻，获得PlTPS4分别定位于GPP、GGPP含量较多的叶绿体和FPP含量较多的线粒体的转基因水稻。从以上转基因水稻后代中挑选目标基因高表达纯合株系进行挥发物收集和分析，并考察对二化螟的天敌二化螟盘绒茧蜂的吸引作用以及对褐飞虱的趋避作用；第二部分是新鉴定了一个受丙甲菌素(ALA)、茉莉酸(JA)、褐飞虱(BPH)和二化螟(SSB)诱导上调表达的水稻萜烯同系物合成基因OsCYP92C21(LOC_Os03g44740 )，通过在酵母中表达后与底物反应产物的鉴定，OsCYP92C21敲除水稻突变体在丙甲菌素诱导后挥发物的分析以及OsCYP92C21过表达水稻与PlTPS4转基因水稻杂交聚合水稻的挥发物分析，最终确定了它在水稻内的功能；第三部分是通过分析OsCYP92C21基因启动子，利用酵母单杂交和DNA-pulldown技术寻找潜在调控OsCYP92C21基因表达的转录因子。
本研究取得的主要结果如下：
1)针对4个外源基因，构建了PTGH3-ctp*-AtCYP82G1*、PTGH3-rbcs-AtCYP82G1*、PTGH3-AtCYP82G1*、PTGH3-PlTPS3、PTGH3-PlTPS4、PTGH3-ctp*-PlTPS4和PTGH3-mtp-PlTPS4这8个植物过表达载体并转入水稻中。通过Southernblot检测和qRT-PCR检测，都在后代获得了目标基因高表达单拷贝纯合株系，分别为：ctp*-AtCYP82G1*-4、24，rbcs-AtCYP82G1*-11、13，AtCYP82G1*-6、7，PlCYP-8、9，PlTPS3-2、19，PlTPS4-9、22，ctp*-PlTPS4-10、20，mtp-PlTPS4-5、9。
2)相比于野生型水稻ZH11，ctp*-AtCYP82G1*、rbcs-AtCYP82G1*、AtCYP82G1*和PlCYP转基因水稻萜烯同系物代谢途径相关挥发物种类和含量没有明显变化；PlTPS3转基因水稻不仅芳樟醇含量升高，而且还能检测到少量DMNT；转PlTPS4、ctp*-PlTPS4和mtp-PlTPS4植株的芳樟醇和DMNT释放量都有所提高，并且当PlTPS4在线粒体中表达时，DMNT释放量最多；当PlTPS4在叶绿体中表达时，产生的芳樟醇最多，其中ctp*-PlTPS4-10还检测到极少量TMTT。
3)构建了pYLTAC380DTH-PlCYP-PlTPS3、pYLTAC380DTH-PlCYP-PlTPS4、pYLTAC380DTH-AtCYP82G1*-PlTPS3、pYLTAC380DTH-AtCYP82G1*-PlTPS4这4个双基因聚合表达载体并转入水稻中。通过qRT-PCR检测获得两个目的基因都高表达的株系，利用GC-MS对这些株系进行挥发物检测。结果发现，挥发物中DMNT和TMTT都得到了提高。
4)野生型水稻(Zhonghua 11，ZH11)在ALA、JA、褐飞虱取食(BPH)和二化螟取食(SSB)处理后，在挥发物中能检测到DMNT和TMTT，证实水稻中存在萜烯同系物合成途径并且被ALA、JA、BPH和SSB所诱导。
5)通过褐飞虱取食水稻(RH和TN1)芯片数据以及丙甲菌素处理水稻(ZH11)前后的转录组数据找到了6个上调表达的CYP基因(OsCYP71AK2 ， OsCYP71C16，OsCYP89B1，OsCYP92A9，OsCYP92A11，OsCYP92C21)，其中只有OsCYP92C21在酵母中表达后的提取物能在体外将橙花叔醇((E)-nerolidol)和香叶基芳樟醇((E,E)- geranyllinalool)分别转化为DMNT和TMTT。
6)与野生型水稻相比，OsCYP92C21基因CRISPR/cas9敲除纯合突变体不能被ALA诱导产生DMNT和TMTT，表明OsCYP92C21基因在水稻内萜烯同系物的合成途径上是不可缺少的。
7)OsCYP92C21过表达植株和野生型水稻的挥发物组成和含量没有明显差别，表明在正常情况下，水稻体内合成DMNT和TMTT的前体物质橙花叔醇和香叶基芳樟醇含量可能很低，不能为OsCYP92C21表达的酶提供足够的底物。要获得高表达萜烯同系物的水稻还需要相应萜类合酶高水平的表达。在此基础上构建了PlTPS4-9/OsCYP92C21-4，PlTPS4-22/OsCYP92C21-4，mtp-PlTPS4-5/OsCYP92C21-4，mtp-PlTPS4-9/OsCYP92C21-4，ctp*-PlTPS4-10/OsCYP92C21-4和ctp*-PlTPS4-20/OsCYP92C21-4杂交聚合水稻。收集聚合水稻挥发物并与野生型和单基因转基因植株进行比较，结果显示，双基因聚合水稻植株释放的DMNT和TMTT显著高于PlTPS4单基因水稻植株；其中，DMNT含量最高的是mtp-PlTPS4-9/OsCYP92C21-4，达到943±22ngplant-1day-1，相比于单基因转基因材料PlTPS4-9和PlTPS4-22提高了73-157倍；ctp*-PlTPS4-10/OsCYP92C21-4散发TMTT最多，可达到179±48ngplant-1day-1，为ctp*-PlTPS4-10的179倍。
8)Y型嗅觉仪试验结果表明PlTPS4-4，mtp-PlTPS4-9，ctp*-PlTPS4-20转基因水稻能够显著吸引雌性二化螟盘绒茧蜂；OsCYP92C21-4和野生型之间无明显差异；双基因聚合水稻PlTPS4-4/OsCYP92C21-4，mtp-PlTPS4-9/OsCYP92C21-4和ctp*-PlTPS4-20/OsCYP92C21-4相比于野生型都能显著吸引二化螟盘绒茧蜂。
9)用酵母单杂交和DNA-pulldown技术寻找到7个可能参与调控OsCYP92C21基因表达的转录因子。
在以上结果的基础上，获得高DMNT和TMTT释放量的转基因水稻，并为将来利用DMNT和TMTT等植物挥发物在田间形成作物—害虫—天敌这3层营养级的关系防治害虫提供理论和技术支撑。
本研究取得的主要结果如下：
1)针对4个外源基因，构建了PTGH3-ctp*-AtCYP82G1*、PTGH3-rbcs-AtCYP82G1*、PTGH3-AtCYP82G1*、PTGH3-PlTPS3、PTGH3-PlTPS4、PTGH3-ctp*-PlTPS4和PTGH3-mtp-PlTPS4这8个植物过表达载体并转入水稻中。通过Southernblot检测和qRT-PCR检测，都在后代获得了目标基因高表达单拷贝纯合株系，分别为：ctp*-AtCYP82G1*-4、24，rbcs-AtCYP82G1*-11、13，AtCYP82G1*-6、7，PlCYP-8、9，PlTPS3-2、19，PlTPS4-9、22，ctp*-PlTPS4-10、20，mtp-PlTPS4-5、9。
2)相比于野生型水稻ZH11，ctp*-AtCYP82G1*、rbcs-AtCYP82G1*、AtCYP82G1*和PlCYP转基因水稻萜烯同系物代谢途径相关挥发物种类和含量没有明显变化；PlTPS3转基因水稻不仅芳樟醇含量升高，而且还能检测到少量DMNT；转PlTPS4、ctp*-PlTPS4和mtp-PlTPS4植株的芳樟醇和DMNT释放量都有所提高，并且当PlTPS4在线粒体中表达时，DMNT释放量最多；当PlTPS4在叶绿体中表达时，产生的芳樟醇最多，其中ctp*-PlTPS4-10还检测到极少量TMTT。
3)构建了pYLTAC380DTH-PlCYP-PlTPS3、pYLTAC380DTH-PlCYP-PlTPS4、pYLTAC380DTH-AtCYP82G1*-PlTPS3、pYLTAC380DTH-AtCYP82G1*-PlTPS4这4个双基因聚合表达载体并转入水稻中。通过qRT-PCR检测获得两个目的基因都高表达的株系，利用GC-MS对这些株系进行挥发物检测。结果发现，挥发物中DMNT和TMTT都得到了提高。
4)野生型水稻(Zhonghua 11，ZH11)在ALA、JA、褐飞虱取食(BPH)和二化螟取食(SSB)处理后，在挥发物中能检测到DMNT和TMTT，证实水稻中存在萜烯同系物合成途径并且被ALA、JA、BPH和SSB所诱导。
5)通过褐飞虱取食水稻(RH和TN1)芯片数据以及丙甲菌素处理水稻(ZH11)前后的转录组数据找到了6个上调表达的CYP基因(OsCYP71AK2 ， OsCYP71C16，OsCYP89B1，OsCYP92A9，OsCYP92A11，OsCYP92C21)，其中只有OsCYP92C21在酵母中表达后的提取物能在体外将橙花叔醇((E)-nerolidol)和香叶基芳樟醇((E,E)- geranyllinalool)分别转化为DMNT和TMTT。
6)与野生型水稻相比，OsCYP92C21基因CRISPR/cas9敲除纯合突变体不能被ALA诱导产生DMNT和TMTT，表明OsCYP92C21基因在水稻内萜烯同系物的合成途径上是不可缺少的。
7)OsCYP92C21过表达植株和野生型水稻的挥发物组成和含量没有明显差别，表明在正常情况下，水稻体内合成DMNT和TMTT的前体物质橙花叔醇和香叶基芳樟醇含量可能很低，不能为OsCYP92C21表达的酶提供足够的底物。要获得高表达萜烯同系物的水稻还需要相应萜类合酶高水平的表达。在此基础上构建了PlTPS4-9/OsCYP92C21-4，PlTPS4-22/OsCYP92C21-4，mtp-PlTPS4-5/OsCYP92C21-4，mtp-PlTPS4-9/OsCYP92C21-4，ctp*-PlTPS4-10/OsCYP92C21-4和ctp*-PlTPS4-20/OsCYP92C21-4杂交聚合水稻。收集聚合水稻挥发物并与野生型和单基因转基因植株进行比较，结果显示，双基因聚合水稻植株释放的DMNT和TMTT显著高于PlTPS4单基因水稻植株；其中，DMNT含量最高的是mtp-PlTPS4-9/OsCYP92C21-4，达到943±22ngplant-1day-1，相比于单基因转基因材料PlTPS4-9和PlTPS4-22提高了73-157倍；ctp*-PlTPS4-10/OsCYP92C21-4散发TMTT最多，可达到179±48ngplant-1day-1，为ctp*-PlTPS4-10的179倍。
8)Y型嗅觉仪试验结果表明PlTPS4-4，mtp-PlTPS4-9，ctp*-PlTPS4-20转基因水稻能够显著吸引雌性二化螟盘绒茧蜂；OsCYP92C21-4和野生型之间无明显差异；双基因聚合水稻PlTPS4-4/OsCYP92C21-4，mtp-PlTPS4-9/OsCYP92C21-4和ctp*-PlTPS4-20/OsCYP92C21-4相比于野生型都能显著吸引二化螟盘绒茧蜂。
9)用酵母单杂交和DNA-pulldown技术寻找到7个可能参与调控OsCYP92C21基因表达的转录因子。
在以上结果的基础上，获得高DMNT和TMTT释放量的转基因水稻，并为将来利用DMNT和TMTT等植物挥发物在田间形成作物—害虫—天敌这3层营养级的关系防治害虫提供理论和技术支撑。