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分枝杆菌(Mycobacteria)是一大类富含脂质和具有包膜(Envelope)结构的革兰氏阳性细菌。其成员既包括引起人类结核病的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)也包括无致病性的耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)等。分枝杆菌包膜的脂稳态对于细菌生长、细胞形态结构、生物膜(Biofilm)的形成以及致病性等都有重要影响。然而，目前关于分枝杆菌脂代谢基因调控网络的研究才刚刚起步，相关全局性调控因子还有待鉴定。本论文以耻垢分枝杆菌为研究对象，发现了广泛调控分枝杆菌脂肪酸β氧化相关基因表达和脂稳态的转录因子(新命名为MmbR)，系统鉴定了它在细菌菌落形态、生物膜形成、脂稳态及药物抗性等方面的广泛调控作用。
实验室前期筛选发现，一个假想TetR家族转录因子MmbR的表达水平变化显著影响细菌菌落表型。以此为基础，本研究首先构建了mmbR基因缺失菌株，随后比较分析了野生型、mmbR基因敲除型以及互补型菌株的生长差异。结果表明，mmbR基因的缺失导致耻垢分枝杆菌菌落表型从典型的皱褶粗糙转变为光滑、细菌正常形成生物膜的能力丧失，而且菌体长度明显变短。而当mmbR基因重新导入敲除菌株中时，互补菌株的表型能够回复到与野生型菌株表型相近，这些结果表明MmbR影响细菌生长和生物膜形成。
为了解析MmbR的调控影响，我们首先利用转录组学分析比较了mmbR敲除型与野生型耻垢分枝杆菌相比全基因组范围内基因表达差异情况。结果显示，mmbR敲除导致2006个基因表达量显著上调，约占耻垢分枝杆菌全基因组1/3，表明MmbR广泛负调控基因的表达。通过KEGG聚类分析差异表达基因发现，在这些差异表达基因中参与脂肪酸代谢和β氧化相关的基因占了绝多数。与其广泛调控功能相一致的是MmbR具有拟核蛋白的特性，这包括体外能够保护DNA免受分枝杆菌拓扑异构酶的作用以及DNaseI的切割、以及在细胞内与染色质DNA共定位等。
有趣的是，差异表达的基因在分布上明显形成了两个高倍数上调的基因组富集区域。通过体外EMSA实验、体内ChIP实验及DNA足迹实验证实，MmbR通过识别保守模体特异性结合自身及附近参与脂肪酸β氧化相关基因簇启动子。而且长链Acyl-CoA和长链脂肪酸可以特异性抑制MmbR的DNA结合活性。更有趣的是，MmbR对邻近基因启动子的亲和性显著高于遥远靶基因的亲和性，具有明显的极性效应。这些结果表明，耻垢分枝杆菌中MmbR兼具拟核蛋白特性和DNA结合极性效应，广泛调控脂肪酸代谢和β氧化基因的表达。
本论文进一步比较分析了MmbR对分枝杆菌脂质代谢的影响，可溶性脂质组学比较研究发现，细菌胞内21种饱和脂肪酸和13种不饱和脂肪酸含量均显著减少，表明MmbR敲除不利于细菌胞内脂肪酸的积累。对野生型和mmbR敲除型耻垢分枝杆菌形成的生物膜进行脂质组测定发现，mmbR敲除导致其形成的生物膜中脂质组成发生显著改变：包括6种分枝酸、8种脂肪酸和4种分枝菌素在内的脂质均显著减少；6种甲基分枝的脂肪酸及8种葡萄糖单霉菌酸酯含量均显著增加。进一步转录组和脂质组关联分析发现，mmbR敲除导致脂肪酸代谢增强，合成甲基分枝的脂肪酸及衍生物增加，而从头合成分枝酸减少，最终也导致了分枝菌素合成的减少。
分枝杆菌被膜脂质组分的变化通常能够直接影响细菌对抗生素的敏感性。通过测定mmbR不同重组型耻垢分枝杆菌分别在利福平和异烟肼两种抗结核药物作用下的存活率和最小抑菌浓度发现，mmbR敲除菌对两种药物均表现为敏感。这些结果表明，mmbR的表达严重影响分枝杆菌胞内脂肪酸的积累、生物膜脂质组分变化和细菌对抗结核药物的敏感性，这些结果与前面MmbR能够广泛抑制脂肪酸代谢和β氧化基因的表达是一致的。
因此，本论文发现了耻垢分枝杆菌中调控脂肪酸β氧化的转录因子MmbR，并解析了它如何通过调控细菌脂代谢来维持细菌脂稳态的分子机制。提出了一个MmbR介导的脂代谢和脂稳态以及细菌生物膜形成调控的模型。这些工作加深了我们对分枝杆菌生物膜形成及脂代谢调控机制的理解。
实验室前期筛选发现，一个假想TetR家族转录因子MmbR的表达水平变化显著影响细菌菌落表型。以此为基础，本研究首先构建了mmbR基因缺失菌株，随后比较分析了野生型、mmbR基因敲除型以及互补型菌株的生长差异。结果表明，mmbR基因的缺失导致耻垢分枝杆菌菌落表型从典型的皱褶粗糙转变为光滑、细菌正常形成生物膜的能力丧失，而且菌体长度明显变短。而当mmbR基因重新导入敲除菌株中时，互补菌株的表型能够回复到与野生型菌株表型相近，这些结果表明MmbR影响细菌生长和生物膜形成。
为了解析MmbR的调控影响，我们首先利用转录组学分析比较了mmbR敲除型与野生型耻垢分枝杆菌相比全基因组范围内基因表达差异情况。结果显示，mmbR敲除导致2006个基因表达量显著上调，约占耻垢分枝杆菌全基因组1/3，表明MmbR广泛负调控基因的表达。通过KEGG聚类分析差异表达基因发现，在这些差异表达基因中参与脂肪酸代谢和β氧化相关的基因占了绝多数。与其广泛调控功能相一致的是MmbR具有拟核蛋白的特性，这包括体外能够保护DNA免受分枝杆菌拓扑异构酶的作用以及DNaseI的切割、以及在细胞内与染色质DNA共定位等。
有趣的是，差异表达的基因在分布上明显形成了两个高倍数上调的基因组富集区域。通过体外EMSA实验、体内ChIP实验及DNA足迹实验证实，MmbR通过识别保守模体特异性结合自身及附近参与脂肪酸β氧化相关基因簇启动子。而且长链Acyl-CoA和长链脂肪酸可以特异性抑制MmbR的DNA结合活性。更有趣的是，MmbR对邻近基因启动子的亲和性显著高于遥远靶基因的亲和性，具有明显的极性效应。这些结果表明，耻垢分枝杆菌中MmbR兼具拟核蛋白特性和DNA结合极性效应，广泛调控脂肪酸代谢和β氧化基因的表达。
本论文进一步比较分析了MmbR对分枝杆菌脂质代谢的影响，可溶性脂质组学比较研究发现，细菌胞内21种饱和脂肪酸和13种不饱和脂肪酸含量均显著减少，表明MmbR敲除不利于细菌胞内脂肪酸的积累。对野生型和mmbR敲除型耻垢分枝杆菌形成的生物膜进行脂质组测定发现，mmbR敲除导致其形成的生物膜中脂质组成发生显著改变：包括6种分枝酸、8种脂肪酸和4种分枝菌素在内的脂质均显著减少；6种甲基分枝的脂肪酸及8种葡萄糖单霉菌酸酯含量均显著增加。进一步转录组和脂质组关联分析发现，mmbR敲除导致脂肪酸代谢增强，合成甲基分枝的脂肪酸及衍生物增加，而从头合成分枝酸减少，最终也导致了分枝菌素合成的减少。
分枝杆菌被膜脂质组分的变化通常能够直接影响细菌对抗生素的敏感性。通过测定mmbR不同重组型耻垢分枝杆菌分别在利福平和异烟肼两种抗结核药物作用下的存活率和最小抑菌浓度发现，mmbR敲除菌对两种药物均表现为敏感。这些结果表明，mmbR的表达严重影响分枝杆菌胞内脂肪酸的积累、生物膜脂质组分变化和细菌对抗结核药物的敏感性，这些结果与前面MmbR能够广泛抑制脂肪酸代谢和β氧化基因的表达是一致的。
因此，本论文发现了耻垢分枝杆菌中调控脂肪酸β氧化的转录因子MmbR，并解析了它如何通过调控细菌脂代谢来维持细菌脂稳态的分子机制。提出了一个MmbR介导的脂代谢和脂稳态以及细菌生物膜形成调控的模型。这些工作加深了我们对分枝杆菌生物膜形成及脂代谢调控机制的理解。