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在胞内病原菌感染的过程中，宿主巨噬细胞会瞬间释放出大量的活性氧物质(ROS)来抑制细菌的生长；相应地，病原菌也进化出了自身的抗氧化生长策略。结核分枝杆菌和牛分枝杆菌是最成功胞内病原菌的典型代表，它们具有很强的抗逆(包括抗氧化)生长能力。然而，关于这些分枝杆菌应答和抗氧化适应的信号通路和分子机制目前还十分不清楚。本研究以牛分枝杆菌BCG作为模式菌株，在发现了CmtR是一个新的氧化信号感应转录因子的基础上，进一步系统解析了CmtR介导分枝杆菌抗氧化适应的信号通路和分子机制。本论文主要取得了以下几个方面的结果：
(1)转录因子CmtR增强分枝杆菌的抗氧化生长能力，而且其24位的半胱氨酸残基在应答以及抗氧化过程中扮演关键作用。通过检测cmtR的不同表达水平对重组BCG菌株在H2O2胁迫下生长的影响，发现在H2O2压力条件下超表达cmtR显著增加了BCG的抗氧化生长能力而敲除该基因则明显降低了BCG的抗氧化生长能力。进一步，RT-qPCR实验分析在H2O2压力条件下分枝杆菌中cmtR基因的表达情况，发现H2O2显著诱导BCG胞内cmtR的表达。氨基酸定点突变实验结合EMSA实验证实：H2O2能够抑制野生型CmtR蛋白的DNA结合活性，但不影响突变体CmtR-C24S蛋白的活性；随后，重组BCG菌株的生长曲线实验证实，野生型cmtR基因而非突变基因cmtR-C24S能够互补cmtR敲除菌株对H2O2的抗性表型。
(2)CmtR与Zur相互作用激活了esx-3操纵子的表达，并通过CmtR-Esx3-Zn2+信号通路调控分枝杆菌的抗氧化生长。通过转录组测序比较野生型和cmtR敲除型菌株间基因表达差异，发现CmtR正调控了Ⅶ型分泌系统esx-3操纵子的表达。然而，EMSA实验表明，CmtR不能直接结合esx-3操纵子的启动子。随后，利用SPR、细菌双杂交实验，我们发现CmtR能够与阻遏子Zur特异性地相互作用。同时，CmtR特异性地抑制Zur对esx-3操纵子的启动子的结合活性，而且H2O2促进了CmtR对Zur的抑制作用。进一步，生长曲线以及ICP-OES实验证实：在H2O2胁迫条件下，敲除esxH和互补失去Zn2+结合能力的突变基因esxH(Mut3)均使BCG的抗氧化生长能力以及细菌胞内的Zn2+含量显著降低；相反，互补野生型基因esxH则能够使BCG的抗氧化生长能力以及细菌胞内的Zn2+含量得到回复。当在培养基中补充Zn2+时，Zn2+能够增强野生型BCG菌株的抗氧化能力。同时，在敲除cmtR的菌株中超表达esxH能够增强BCG的抗氧化生长能力。综合上述实验结果，EsxH促进Zn2+的吸收并有利于增强BCG的抗氧化生长能力，且CmtR调控BCG的抗氧化生长能力是通过激活esx-3操纵子基因esxH的表达来实现的。最后，EMSA结合RT-qPCR实验表明，Zn2+能够抑制CmtR的DNA结合活性并能够显著诱导BCG胞内cmtR的表达。因此，这些实验结果表明CmtR通过CmtR-Zur-Esx3-EsxH-Zn2+信号通路调控分枝杆菌的抗氧化生长能力。
(3)CmtR有利于BCG抑制巨噬细胞内ROS的产生以及吞噬溶酶体的成熟，增强分枝杆菌在宿主体内的存活。通过流式细胞仪分析重组BCG菌株感染的巨噬细胞内ROS染料的平均荧光强度，发现cmtR敲除型菌株以及突变体基因cmtR-C24S的互补菌株均会显著增加巨噬细胞内ROS指示剂的平均荧光强度。随后，利用荧光共定位比较感染的巨噬细胞内吞噬溶酶体成熟的早期以及晚期标记物的平均荧光强度，发现cmtR超表达菌株显著降低了吞噬溶酶体成熟标记物的平均荧光强度；相反，cmtR敲除型菌株则明显增加了细胞内标记物的荧光强度。这些实验结果表明，BCG胞内cmtR的表达能够抑制巨噬细胞内ROS产生以及吞噬溶酶体的成熟。进一步，利用不同的巨噬细胞模型，我们发现cmtR的表达增加了BCG的胞内存活。最后，小鼠实验证实：超表达cmtR能够显著增加BCG在感染小鼠肺部的存活，而敲除该基因则使得BCG在感染小鼠肺部的存活明显降低。
本研究成功鉴定了一个新的氧化感应子CmtR，系统解析了其调控分枝杆菌抗氧化生长的信号通路和分子机制，进一步发现了它在抵抗宿主巨噬细胞免疫中的作用。这些工作拓展了我们对分枝杆菌抗氧化适应分子机制的认识，也强化了我们对病原与宿主互作机制的了解。
(1)转录因子CmtR增强分枝杆菌的抗氧化生长能力，而且其24位的半胱氨酸残基在应答以及抗氧化过程中扮演关键作用。通过检测cmtR的不同表达水平对重组BCG菌株在H2O2胁迫下生长的影响，发现在H2O2压力条件下超表达cmtR显著增加了BCG的抗氧化生长能力而敲除该基因则明显降低了BCG的抗氧化生长能力。进一步，RT-qPCR实验分析在H2O2压力条件下分枝杆菌中cmtR基因的表达情况，发现H2O2显著诱导BCG胞内cmtR的表达。氨基酸定点突变实验结合EMSA实验证实：H2O2能够抑制野生型CmtR蛋白的DNA结合活性，但不影响突变体CmtR-C24S蛋白的活性；随后，重组BCG菌株的生长曲线实验证实，野生型cmtR基因而非突变基因cmtR-C24S能够互补cmtR敲除菌株对H2O2的抗性表型。
(2)CmtR与Zur相互作用激活了esx-3操纵子的表达，并通过CmtR-Esx3-Zn2+信号通路调控分枝杆菌的抗氧化生长。通过转录组测序比较野生型和cmtR敲除型菌株间基因表达差异，发现CmtR正调控了Ⅶ型分泌系统esx-3操纵子的表达。然而，EMSA实验表明，CmtR不能直接结合esx-3操纵子的启动子。随后，利用SPR、细菌双杂交实验，我们发现CmtR能够与阻遏子Zur特异性地相互作用。同时，CmtR特异性地抑制Zur对esx-3操纵子的启动子的结合活性，而且H2O2促进了CmtR对Zur的抑制作用。进一步，生长曲线以及ICP-OES实验证实：在H2O2胁迫条件下，敲除esxH和互补失去Zn2+结合能力的突变基因esxH(Mut3)均使BCG的抗氧化生长能力以及细菌胞内的Zn2+含量显著降低；相反，互补野生型基因esxH则能够使BCG的抗氧化生长能力以及细菌胞内的Zn2+含量得到回复。当在培养基中补充Zn2+时，Zn2+能够增强野生型BCG菌株的抗氧化能力。同时，在敲除cmtR的菌株中超表达esxH能够增强BCG的抗氧化生长能力。综合上述实验结果，EsxH促进Zn2+的吸收并有利于增强BCG的抗氧化生长能力，且CmtR调控BCG的抗氧化生长能力是通过激活esx-3操纵子基因esxH的表达来实现的。最后，EMSA结合RT-qPCR实验表明，Zn2+能够抑制CmtR的DNA结合活性并能够显著诱导BCG胞内cmtR的表达。因此，这些实验结果表明CmtR通过CmtR-Zur-Esx3-EsxH-Zn2+信号通路调控分枝杆菌的抗氧化生长能力。
(3)CmtR有利于BCG抑制巨噬细胞内ROS的产生以及吞噬溶酶体的成熟，增强分枝杆菌在宿主体内的存活。通过流式细胞仪分析重组BCG菌株感染的巨噬细胞内ROS染料的平均荧光强度，发现cmtR敲除型菌株以及突变体基因cmtR-C24S的互补菌株均会显著增加巨噬细胞内ROS指示剂的平均荧光强度。随后，利用荧光共定位比较感染的巨噬细胞内吞噬溶酶体成熟的早期以及晚期标记物的平均荧光强度，发现cmtR超表达菌株显著降低了吞噬溶酶体成熟标记物的平均荧光强度；相反，cmtR敲除型菌株则明显增加了细胞内标记物的荧光强度。这些实验结果表明，BCG胞内cmtR的表达能够抑制巨噬细胞内ROS产生以及吞噬溶酶体的成熟。进一步，利用不同的巨噬细胞模型，我们发现cmtR的表达增加了BCG的胞内存活。最后，小鼠实验证实：超表达cmtR能够显著增加BCG在感染小鼠肺部的存活，而敲除该基因则使得BCG在感染小鼠肺部的存活明显降低。
本研究成功鉴定了一个新的氧化感应子CmtR，系统解析了其调控分枝杆菌抗氧化生长的信号通路和分子机制，进一步发现了它在抵抗宿主巨噬细胞免疫中的作用。这些工作拓展了我们对分枝杆菌抗氧化适应分子机制的认识，也强化了我们对病原与宿主互作机制的了解。