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背景： 全球肺癌的发病率和死亡率均位居所有肿瘤相关疾病的首位，每年新发病例约180万人，有近159万人死于肺癌。其中约85%的肺癌新发病例和大多数的死亡病例属于非小细胞肺癌（NSCLC），包括腺癌、鳞癌、大细胞癌及细支气管肺泡癌。大量流行病学研究结果表明，环境因素如吸烟、空气污染；遗传因素如肿瘤家族史；职业化学毒物暴露如电离辐射等均是影响肺癌发生发展的主要危险因素。目前，随着外科手术、化疗和分子靶向治疗等技术的发展，肺癌患者的存活率有所改善和提高，但是晚期肺癌病人的存活率仍不足5%，其5年生存率也仅约为15%。其中一个重要的原因是影响肺癌发生发展的明确的分子机制仍不清楚。因此，深入研究阐明影响肺癌的潜在生物学机制对提高肺癌的诊断，预防和治疗效果是至关重要的。 自噬是一种溶酶体介导的细胞内代谢过程，自噬可将胞质内的细胞器等物质吞噬和输送到溶酶体，在溶酶体中完成物质的降解和再循环利用。理论上，自噬可通过清除受损的细胞器、毒性代谢产物和细胞内病原体等途径促进细胞存活；也可通过过度的自我消化和降解胞内重要物质等方式促进细胞死亡。但是，自噬在调控细胞存活或（和）细胞死亡的信号通路中发挥的生物学作用还不完全明确。目前研究发现，细胞自噬与肺癌的发生发展关系密切，在发生自噬现象的不同阶段，自噬相关基因的调控作用各不相同。哺乳动物中的BECN1基因是酵母自噬基因atg6/VPS30的同系物，也是参与调控自噬水平的特异性基因，可翻译表达Beclin1蛋白。研究表明BECN1参与调控自噬体的形成过程，通过调控自噬水平影响肿瘤细胞的增殖和死亡。 长链非编码RNA（lncRNA）是长度大于200个核苷酸，不具有编码蛋白质能力，却能发挥调控基因表达作用的进化上高度保守的一类RNA分子。最近研究表明，lncRNA可以在转录、转录后和表观遗传等水平上调控基因的表达，并在肺癌等多种肿瘤的生物学进程中发挥着重要的作用。越来越多的研究证实lncRNA与肺癌的形成、发展、迁移和转移等过程密切相关，例如MEG3，HOTAIR和MALAT1等。此外，一些研究发现，肺癌中lncRNA的表达调控模式涉及成千上万个基因的同时表达，lncRNA可通过参与大量信号通路的调控过程从而发挥其重要作用。然而，迄今为止lncRNA在肺癌中明确的调控机制和分子途径还不清楚。因此，识别并阐明肺癌相关lncRNA分子及其生物学功能有助于提高肺癌的预防、诊断和治疗水平。最近，Hung等人研究发现lncRNA P21-associated noncoding RNA DNA damage-activated(PANDA)在正常人胚肺成纤维细胞中可与转录因子NF-YA相互作用从而抑制促凋亡基因的表达。随后，Han等人研究证实lncRNA PANDA与肺癌预后关系密切，它可通过调控Bcl-2的表达影响肺癌细胞的凋亡。Bcl-2不仅是一种抗凋亡蛋白，而且能与Beclin1蛋白通过BH3结构域相互作用，参与调控肺癌细胞的自噬水平。我们课题组前期已经证实16HBE恶性转化的肺癌细胞中Beclin1蛋白的表达下降，研究发现BECN1与细胞自噬过程关系密切。因此，我们猜测肺癌中lncRNA PANDA可能与BECN1存在关联，PANDA在影响肺癌发生发展的过程中可能涉及到自噬和凋亡途径。 目前，肺癌中有关lncRNA的大多数研究仍将焦点放在凋亡相关的信号通路上，肺癌中lncRNA与细胞自噬的关系却鲜有报道。阐明lncRNA在肺癌发展过程中的分子机制将是探索未来肺癌治疗新策略的关键一步。本研究为认识了解肺癌的发展过程提供了一个全新的视角，旨在阐明肺癌中PANDA与细胞自噬和凋亡的关系，并探讨PANDA在肺癌中发挥的生物学作用及相关的分子机制。 方法： 1.采用qRT-PCR方法检测实验室276对人肺癌组织及其癌旁正常肺组织中lncRNA PANDA和BECN1mRNA的相对表达量，同时分析lncRNA PANDA表达量与肺癌病例临床特征的关系。 2.采用qRT-PCR方法检测实验室9种肺癌细胞系和4种永生化正常肺细胞系中lncRNA PANDA的相对表达量。 3.核质分离实验检测lncRNA PANDA在肺癌细胞的胞核和胞浆中的亚细胞定位情况。 4.构建lncRNA PANDA过表达及其对照质粒，利用lipofectamine3000转染肺癌细胞系PC9和A549，使其过表达PANDA，同时设置空白对照组细胞。 5.通过qRT-PCR和Western Blot方法检测过表达组和空白对照组细胞内BECN1mRNA及其相应的蛋白Beclin1的表达量阐明肺癌细胞中PANDA与BECN1mRNA的关系；利用荧光显微镜观察GFP-LC3点聚集水平和Western Blot方法检测LC3-Ⅱ的表达量从而阐明PANDA对肺癌细胞自噬水平的影响。 6.通过体外细胞功能实验说明lncRNA PANDA在影响肺癌发展过程中发挥的作用。利用CCK8细胞增殖实验检测PANDA对肺癌细胞增殖能力的影响；利用Hoechst33258实验检测PANDA对肺癌细胞凋亡水平的影响。 7.利用GFP-BECN1与DsRed-Mit共定位实验检测PANDA是否通过线粒体凋亡途径参与调控肺癌细胞的凋亡过程。 8.利用蛋白质免疫共沉淀实验探讨PANDA诱导BECN1表达水平升高后，线粒体中Beclin1是否与抗凋亡蛋白Bcl-2相互作用，以Beclin1-Bcl-2复合物的形式影响肺癌细胞的自噬和凋亡过程。 结果： 1.肺癌组织中lncRNA PANDA的表达水平低于同一个体匹配的癌旁正常肺组织，呈低表达状态（低表达vs.高表达=174vs.102，P＜0.05），且lncRNA PANDA表达水平与肺癌的临床进展（Ⅲ+Ⅳvs.Ⅰ+Ⅱ，P=0.001）、肿瘤大小（T3+T4vs.T1+T2，P=0.001）有关。同时发现，肺癌组织中BECN1基因的表达水平低于同一个体匹配的癌旁正常肺组织，呈低表达状态（低表达vs.高表达=189vs.87，P＜0.01），且PANDA与BECN1mRNA在肺癌组织中的表达水平存在正相关关系（r=0.789，P＜0.05）。 2.LncRNA PANDA在肺癌细胞中的表达水平呈现低于正常肺细胞系的趋势。 3.核质分离实验结果表明PANDA在细胞核中的表达量大于其在细胞质中的表达量（P＜0.05）。 4.成功构建过表达PANDA的肺癌细胞系PC9和A549。qRT-PCR和Western Blot实验结果表明PANDA过表达组的肺癌细胞中BECN1mRNA及其相应蛋白Beclin1的表达量明显增加。 5.在PANDA和GFP-LC3双质粒共转染实验中，利用荧光显微镜观察发现PANDA过表达组的肺癌细胞GFP-LC3点聚集现象更加明显。Western Blot实验结果表明PANDA过表达组自噬标志物LC3-Ⅱ蛋白的表达水平增加。 6.CCK8细胞增殖实验结果证实PANDA高表达组的OD值低于空白对照组细胞的OD值（P＜0.05）。Hoechst33258实验发现，与对照组相比，PANDA高表达组的肺癌细胞核中出现浓染致密的颗粒块状荧光明显增加，并发现大量细胞核碎裂现象。 7.GFP-BECN1与DsRed-Mit共定位实验结果发现，肺癌细胞发生凋亡时，GFP-BECN1与线粒体中DsRed-Mit的定位区域大体相同。 8.蛋白质免疫共沉淀实验结果发现BECN1表达水平升高后，Beclin1与Bcl-2蛋白的结合量没有明显差异。 结论： 1.LncRNA PANDA在肺癌组织中处于低表达状态，且PANDA的表达水平与肺癌的临床进展和肿瘤大小有关；此外，肺癌组织中lncRNA PANDA与BECN1的表达水平存在正相关关系。 2.肺癌中lncRNA PANDA能够增加BECN1mRNA的表达量，并提高细胞自噬水平。 3.LncRNA PANDA具有抑制肺癌细胞增殖的作用。 4.LncRNA PANDA具有促进肺癌细胞凋亡的作用。调控细胞凋亡的过程是BECN1通过线粒体途径完成的，且这个过程不涉及到Beclin1与Bcl-2蛋白的结合。