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第一部分新生大鼠心肌细胞的体外培养
目的：应用酶消化法进行体外新生大鼠心肌细胞的原代培养。
方法：1-3日龄新生wistar大鼠,用0.08％胰蛋白酶和0.06％二型胶原酶重复消化心肌组织多次,收集的细胞用含20％胎牛血清的DMEM培养基混悬并过滤,采用差速贴壁法纯化心肌细胞后台盼蓝染色计数存活心肌细胞百分比,检测心肌细胞活性。之后将混悬于培养基中的心肌细胞置于CO2培养箱孵育,连续观察并记录心肌细胞生长情况及形态变化,每2-3天换液一次。心肌细胞培养72h,进行横纹肌肌动蛋白(α-sacomericactin)免疫细胞化学反应,检测α-sacomericactin阳性表达率,检测心肌细胞的特异性。
结果：
1.采用0.08％胰蛋白酶和0.06％胶原酶联合消化心室肌组织,心肌细胞的收获率高,细胞分散效果好,无明显的组织碎块和细胞碎片。
2.差速贴壁后,台盼蓝染色检测心肌细胞活性,存活率为95.6％,95％可信区间(CI)为(89.9％,99.1％)。
3.培养的心肌细胞2～3h后开始贴壁生长,12～24h明显增殖,3～4d后细胞汇合成片。在倒置显微镜下心肌细胞呈圆形,梭形,多角形,伸出伪足,出现自发性节律性搏动。
4.心肌细胞α-sacomericactin阳性表达率即心肌细胞的纯度为94％,95％的可信区间(CI)为(90.4,97.6)。
结论：
1.应用酶消化法可简便,快速地获得大量活力高,特意性强的心肌细胞。
2.体外培养大鼠心肌细胞可以为心脏生理、病理及药理的实验研究提供新模型。
目的：研究线粒体KATP通道开放保护异丙肾上腺素致体外培养大鼠心肌细胞损伤的线粒体机制。
方法：应用10μM异丙肾上腺素连续48小时作用于体外培养的大鼠心肌细胞建立模型。实验分为两部分：第一部分观察线粒体KATP通道开放对线粒体膜电位的影响；第二部分观察线粒体KATP通道开放对线粒体通透性转换的影响。培养的大鼠心肌细胞随机分为对照组(CON组)、异丙肾上腺素造模组(ISO组)、尼可地尔组(NIC组)、尼可地尔处理组(NIC+ISO组)(在造模前20min加入1mM nicorandil)、5-HD处理组(5-HD+NIC+ISO组)(在加入nicorandil前10min加入500μM 5-HD)、环孢菌素A组(CsA组)、环孢菌素A处理组(CsA+ISO组)(在造模前20min加入5mM CsA)。第一部分应用流式细胞仪记录各组线粒体膜电位的变化；第二部分进行线粒体分离提纯,应用紫外分光光度仪检测线粒体体积,并用Cacl2处理15min观察线粒体体积的变化趋势及程度。
结果：
1.ISO组(模型组)红色荧光细胞数占总细胞数的比例为37.19±2.31％,△、ψm水平较CON组明显降低,与CON组84.76±1.73％相比差异有统计学意义(q=60.39,P<0.01),在ISO作用下△ψm消散:NIC+ISO组在ISO组基础上提前20min加入nicrandil(特异性mitoKATP开放剂)进行药物干预,检测红色荧光细胞所占比例为70.99±1.68％,△ψm水平较ISO组明显回升,与ISO组37.19±2.31％相比差异有统计学意义(q=42.91,P<0.01),尼可地尔恢复△ψm极化状态：5-HD+NIC+ISO组在NIC+ISO组基础上提前10min加入5-HD(特异性mitoKATP通道阻滞剂)进行干预,检测红色荧光细胞所占比例为46.07±2.18％,△ψm水平较NIC+ISO组又明显下降,与NIC+ISO组70.99±1.68％相比差别有统计学意义(q=31.64,P<0.01),△ψm消散,5-HD拮抗了尼可地尔的保护作用。
2.ISO组(模型组)红色荧光细胞数占总细胞数的比例为37.19±2.31％,△ψm水平较CON组明显降低,与CON组84.76±1.73％相比差异有统计学意义(q=60.39,P<0.01),ISO致△ψm明显消散；CsA+ISO组在ISO组的基础上提前20min加入CsA(特异性mPTP阻滞剂),红色荧光细胞数所占比例为69.77±1.88％,△ψm水平较ISO组明显回升,与ISO组37.19±2.31相比差别有统计学意义(q=39.53,P<0.01),△ψm恢复极化状态。
3.ISO组线粒体吸光度(A1-A2)为0.0702±0.0103,下降不明显,诱发mPTP开放,线粒体体积没有出现明显增大较初始状态变化不大,与CON组0.2995±0.0142相比差异有统计学意义(q=55.92,P<0.01);CsA+ISO组在ISO组基础上提前20min加入CsA(特异性mPTP阻滞剂),线粒体吸光度(A1-A2)为0.2315±0.0101,较ISO组下降明显,线粒体体积较初始状态增大,与ISO组0.0702±0.0103相比差异有统计学意义(q=39.34,P<0.01),ISO使mPTP开放；NIC+ISO在ISO组基础上提前20min加入nicorandil(特异性mitoKATP开放剂)进行药物干预,线粒体吸光度(A1-A2)为0.2187±0.0089,较ISO组下降明显,线粒体体积较初始状态增大,与ISO组0.0702±0.0103相比差异有统计学意义(q=36.22.P<0.05),预处理尼可地尔可以阻止mPTP开放；5-HD+NIC+ISO组在NIC+ISO基础上提前10min加入5-HD(特异性mitoKAaV阻滞剂)进行干预,线粒体吸光度(A1-A2)为0.1012±0.0126,较NIC+ISO组下降不明显,线粒体体积较初始状态变化不大,与NIC+ISO组0.2187±0.0089相比差异有统计学意义(q=28.66,P<0.05),5-HD取消了尼可地尔的保护效应,mPTP开放；
结论：
1.ISO可以使心肌细胞线粒体膜电位耗散/降低。
2.ISO可以使心肌细胞线粒体通透性转换孔开放。
3.抑制线粒体通透性转换孔开放可以防止ISO引起的心肌细胞线粒体膜电位耗散/降低。
4.线粒体ATP敏感性钾通道开放剂尼可地尔可以拮抗ISO引起的心肌细胞线粒体膜电位耗散/降低。
5.线粒体ATP敏感性钾通道开放剂尼可地尔可以拮抗ISO引起的心肌细胞线粒体通透性转换孔开放。