外源性Wnt5a激活K562细胞Wnt5a/Ca信号传导途径及其生物学效应研究

• 作 者: 李招权
• 机 构: 第三军医大学
• 出 处: 第三军医大学
• 发表日期: 2008年2期
• 关键词: 细胞周期

研究目的：
Wnt5a是Wnt蛋白家族重要成员之一，不仅与个体发育、细胞粘附、迁移、增殖、分化、极性和死亡等相关，甚至与肿瘤发生关系密切。目前研究发现，Wnt5a在肿瘤中既有增高表达又有下调表达，它既可能激活Wnt/β-catenin信号传导途径，又可能激活非经典Wnt5a/Ca2+信号传导途径，故Wnt5a既可能是癌基因，又可能是抑癌基因。关于Wnt5a在血液病中表达及其作用的研究鲜见报道，更罕见外源性Wnt5a对白血病细胞有何生物学效应的研究报道。为此，本研究首先检测了Wnt5a及β-catenin在一些血液病病例及白血病细胞株中的表达情况，在此基础上，以K562细胞为细胞模型，观察外源性Wnt5a是否激活非经典Wnt5a/Ca2+信号传导途径，并观察其生物学效应，以探讨Wnt5a在白血病发生中的作用和机制，为白血病的治疗寻求新的治疗靶点。
研究方法：
1.应用RT-PCR方法检测31例各类血液病病例样本和3种白血病细胞株Wnt5a表达，并检测11例髓细胞白血病病例样本和3种白血病细胞株β-catenin的表达。
2.应用HEK293细胞扩增带有标记基因GFP的重组腺病毒AdWnt5a和AdGFP，以AdWnt5a和AdGFP分别感染CHO细胞，制备Wnt5a和GFP条件培养液，以westernblot鉴定条件培养液Wnt5a蛋白的表达。
3.以荧光染料Fluo-3/AM预染K562细胞，以激光共聚焦显微镜分别观察Wnt5a和GFP条件培养液对K562细胞Ca2+内流的影响，观察外源性Wnt5a是否激活K562细胞非经典Wnt5a/Ca2+信号传导途径。
4.分别以Wnt5a和GFP条件培养液培养K562细胞1～5 d，以RT-PCR、免疫细胞化学和western blot等方法观察K562细胞β-catenin和cyclin D1的表达变化，观察外源性Wnt5a与Wnt/β-catenin信号传导途径的作用关系。
5.分别以Wnt5a和GFP条件培养液培养K562细胞1～5 d，观察外源性Wnt5a对K562细胞的生物学效应：每天计数细胞数量，绘制生长曲线，观察外源性Wnt5a对细胞增殖的影响；以流式细胞仪分析细胞周期分布，观察外源性Wnt5a对细胞周期分布的影响；以DNA Ladder电泳和AO/EB染色法，观察外源性Wnt5a对细胞凋亡的影响；细胞以瑞氏染液染色，光镜下观察细胞形态学改变，并利用免疫细胞化学染色检测细胞表面分化抗原CD13、CD41、CD68和GIyA的表达变化，观察外源性Wnt5a对细胞分化的影响。
实验结果：
1.Wnt5a在髓细胞白血病病例样本及K562、HL-60细胞中表达缺失，而β-catenin在多数髓细胞白血病病例样本及K562细胞和Jurkat细胞呈高表达。
2.分别利用重组腺病毒AdWnt5a、AdGFP感染CHO细胞，成功制备Wnt5a及GFP条件培养液，经western blot鉴定Wnt5a条件培养液含Wnt5a蛋白，而GFP条件培养液无表达。
3.GFP条件培养液不能促进K562细胞Ca2+内流，而Wnt5a条件培养液可促进K562细胞Ca2+内流，且这种作用可被Wnt5a抗体抑制。
4.Wnt5a条件培养液培养不能下调K562细胞β-catenin mRNA的表达，但能下调K562细胞β-catenin及cyclin D1蛋白的表达。
5.Wnt5a条件培养液对K562细胞的生物学效应有：细胞增殖明显受抑制；细胞周期分布G1期细胞比例增多，S期及G2期细胞比例减少；细胞形态出现了向成熟细胞分化的特征，细胞表面分化抗原CD13、CD41及GIyA表达变化不明显，CD68表达阳性率显著升高；细胞DNA Ladder电泳未出现明显梯形条带，激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡率无明显变化。
研究结论：
1.Wnt5a表达缺失和β-catenin高表达可能是髓细胞白血病的发生相关因素。
2.外源性Wnt5a可激活K562细胞非经典Wnt5a/Ca2+信号传导途径，并在蛋白水平下调K562细胞β-catenin及cyclin D1表达，提示在K562细胞中，外源性Wnt5a可抑制Wnt/β-catenin信号传导途径。
3.外源性Wnt5a可使K562细胞发生G1期阻滞，抑制K562细胞的增殖，诱导K562细胞向单核细胞分化，但无诱导K562细胞凋亡作用。