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花生四烯酸在低渗牵张增强胃平滑肌IK(Ca)中的作用
随着膜片钳技术的发展,许多研究发现，低渗牵张能调控细胞膜上众多离子通道，激活多种信号转导途径。我室以往的研究表明，在豚鼠胃窦环行平滑肌细胞上，低渗牵张激活了电压依赖性钙通道、容积敏感氯通道、毒蕈碱电流、钙激活钾通道、延迟整流性钾电流等[8,9,12,10]；其中钙激活钾通道的激活是由于细胞内钙离子浓度的升高引起，那么，细胞内钙的释放又由什么信号介导的呢?我们以前的实验证明不是由IP3介导的[1]，因此我们必须考虑其它第二信使。近来许多研究表明，低渗牵张能激活细胞膜上的磷脂酶而分解膜磷脂，产生花生四烯酸等不饱和脂肪酸[48,49,53]，花生四烯酸(arachidonicacid，AA)能调控细胞膜上的离子通道，介导细胞内的信号转导[55,56,57,58]。本实验的目的就是探讨是否AA介导了低渗牵张增强钙激活钾电流。
本实验以豚鼠为实验动物，用Ⅱ型胶原酶急性分离其胃窦环行肌单细胞，分离的单细胞大多数结构完整且保持了良好的生理功能。我们应用传统全细胞模式的膜片钳技术，研究了AA在低渗牵张增强豚鼠胃窦环行平滑肌细胞钙激活钾电流(calciumactivatedpotassiumcurrent，IK(Ca))中的作用及机制。
本文的主要实验结果如下：
一、AA在低渗牵张增强胃平滑肌IK(Ca)中的作用
1.低渗牵张和AA对IK(Ca)及自发性瞬间外向钾电流的作用
在传统全细胞模式下，当电极内液含0.1μMEGTA时，钙激活钾电流IK(ca)可被去极化刺激所激活。细胞膜电位钳制在-60mV，用单个脉冲刺激使去极化至+60mV，每15s采样一次，时程400毫秒。IK(ca)在200mOsm低渗液灌流139秒后开始升高，稳定时在+60mV显著升高达168.25±16.11％；给药10μMAA165秒后，IK(ca)开始升高，稳定时在+60mV显著升高达158.53±20.48％。
在相同模式下，膜电位钳制在-20mV，可以记录到自发性瞬间外向钾电流(spontaneoustransientoutwardcurrents，STOCs)。低渗细胞膜牵张和10μMAA均能使STOCs显著增加。
2.外源性AA在低渗牵张增强IK(Ca)中的作用
在传统全细胞模式，电极内液含0.1μMEGTA，细胞膜电位钳制在-60mV，每10s给予20mV增加幅度的阶跃刺激，使其去极化依次从-40mV到+100mV时间持续400ms，可以记录出IK(Ca)。依次用等渗液(290mOsm)、低渗液(200mOsm)、低渗液(含10μMAA)灌流，当膜电位去极化至+60mV时，细胞膜牵张使IK(Ca)升高至184.20±17.66％，当细胞膜牵张加10μMAA使IK(Ca)进一步升高至281.28±28.27％；10μMAA可以使IK(Ca)升高，当膜电位去极化至+60mV时，IK(Ca)升高至171.78±20.30％，当AA存在下再施细胞膜牵张时，IK(Ca)进一步升高至311.54±44.36％。在以上两种情况下，IK(Ca)最后升高的幅度没有显著性差异。
在相同模式下，膜电位钳制在-20mV，可以记录到STOCs。10μMAA进一步增强低渗细胞膜牵张引致的STOCs增加效应。
3内源性AA及其代谢产物在低渗牵张增强IK(Ca)中的作用。
在全细胞的记录模式下，用10μMNDGA(一种脂氧化酶抑制剂)预孵细胞15分钟后，能显著抑制AA对IK(Ca)的增加作用，使其增加的百分比从145±9％下降到110±40％。NDGA也抑制了低渗细胞膜牵张引致的IK(Ca)增加作用，使其增加的百分比从170±10％下降到142±3％。
当电极内液含100μMDEDA时(一种磷酯酶A2抑制剂)，击破细胞膜10分钟之后，观察到DEDA显著抑制低渗细胞膜牵张引致的IK(Ca)增加作用，使其增加的百分比从164.3±9.8％下降到113.4±3.6％。
二、AA在低渗牵张增强胃平滑肌IK(Ca)中的作用机制
1.细胞外钙在AA增强IK(Ca)的作用
在全细胞记录模式下，用无钙等渗液(外加EGTA10μM)灌流细胞时，10μMAA不再增加IK(Ca)。
5μM尼卡地平(一种L-型钙通道的阻断剂)，不能抑制AA对IK(Ca)的增加作用。
20μM钆(一种牵张激活通道的阻断剂)，能完全抑制AA对IK(Ca)的增加作用。
2.细胞内钙在AA增强IK(Ca)的作用。
3mg/ml肝素(一种强效的IP3诱导的钙释放抑制剂)，它能显著抑制STOCs，但是不能抑制AA对STOCs的增加作用。
10μM里安乐碱(一种特殊的钙诱导钙释放抑制剂)，灌流8分钟之后它耗空了钙库，1mM咖啡因(钙诱导钙释放激动剂)不再引起STOCs的增加，而此时AA也不能引起STOCs的增加。
以上结果提示：低渗膜牵张可能激活了磷酯酶A2，水解膜磷脂产生了AA，AA作为第二信使介导细胞外钙的内流并激活钙诱导钙释放，从而使IK(Ca)增加。