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口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth diseasevirus，FMDV)引起偶蹄类动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，被世界动物卫生组织列为A类动物疫病。该病除造成患病动物死亡外，还可引起患病动物的生产性能降低、动物产品的国际贸易受阻等，对畜牧业及其相关产业带来巨大的经济损失。然而，目前尚未存在有效的措施用于FMD疫病的防控。 RNA干扰技术为抗FMDV感染方面的研究提供了新的思路。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指由功能性双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)引起的序列特异性转录后同源靶基因沉默现象，是近几年迅速发展起来的一种用于抗病毒研究的新技术。此外，腺病毒载体因具有宿主范围广、复制过程不整合入宿主基因组、遗传学稳定性高等诸多优点而被广泛用作基因治疗载体。 根据GenBank中注册的O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)基因序列设计合成了1对用于扩增FMDV VP1基因的引物，经RT-PCR法从10份疑似口蹄疫病料中扩增出FMDV的VP1基因，对获得的VP1基因进行了序列测定及序列分析，结果表明，10份分离自广东地区的病料均为O型FMDV；VP1基因序列分析显示，这10株0型FMDV，与属于猪毒群O型FMDV HKN/2002、O/HKN/6/96、O/HKN/1/99、O/HKN/1/2002、O/HKN/12/2004、Otaiwan97 iso106/112、Yunlin、O-TW-257-2009的遗传进化关系密切，与泛亚型毒株O型FMDV Tibet/CHA/99、GD/China/86、UKG/35/2001、O/JPN/2000遗传进化关系较远，为不同的基因型。 本研究根据科研团队前期获得的重组质粒pShuttle-3D、pShuttle-L、pAdeno-2B-VP1，并以此为模板，通过PCR分别扩增得到U6启动子+3D-siRNA融合片段、U6启动子+L-siRNA融合片段、U6启动子+2B-siRNA融合片段+U6启动子+VP1-siRNA融合片段，再将这3个融合片段分别克隆到pUC-57载体上，得到串联结构、能分别独立转录的重组质粒pUC-3D-L-2B-VP1；体外连接法将I-CeuⅠ/PI-SceⅠ双酶切重组质粒pUC-3D-L-2B-VP1得到的目的片段与人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X载体骨架连接，得到重组腺病毒载体质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1；重组质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1 PacⅠ酶切线性化后，利用脂质体Lipofectamin TM2000作为转染试剂，通过包装细胞HEK293包装，得到携带有FMDV3D-L-2B-VP1多基因串联siRNA重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1；经PCR鉴定正确后增殖、纯化；终点稀释法测得病毒滴度为3×1010 pfu/mL。对团队前期研究获得的重组腺病毒rAdeno-2B-VP1进行增殖、纯化及滴度测定，病毒滴度达4×1010 pfu/mL。 重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1以3×106 TCID50的量接种IBRS-2细胞，12h后再感染100 TCID50 FMDV(O/HKN/2003)，FMDV吸附1 h后，立即以3×106 TCID50的重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1接种IBRS-2细胞。结果显示，采用预防和治疗相结合的方式，72 h内可以100％抑制FMDV在IBRS-2细胞中的复制。重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1在细胞水平抗FMDV感染具有较好的保护效果。 应用乳鼠和豚鼠作为动物模型，评估重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1在动物个体水平抗FMDV感染的效果。各组乳鼠分别预先接种纯化重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1、纯化重组腺病毒rAdeno-2B-VP1，接种量分别为108PFU；24 h后感染100 LD50 FMDV，结果发现，108 PFU纯化重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1在7 d内对乳鼠的保护率达到67％；各组豚鼠(5只/组)，分别预先接种未纯化(即纯化前)重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1、纯化重组腺病毒rAdeno-2B-VP1及纯化重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1，接种量分别为108 PFU；24 h后感染100 ID50FMDV，并分别立即以未纯化重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1、纯化重组腺病毒rAdeno-2B-VP1及纯化重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1进行治疗，接种量分别为108PFU。结果发现，两次注射纯化重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1保护率在4 d内达到了100％，至第7 d保护率维持在60％。以上结果说明用108PFU纯化重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1进行预防和治疗能最大程度地增强豚鼠对FMDV的抵抗力，而且纯化的重组腺病毒比未纯化的重组腺病毒防控效果较高(对豚鼠的保护率高20％)。虽然rAdeno-3D-L-2B-VP1相比rAdeno-2B-VP1，在7 d内对豚鼠的保护率基本相当，但较后者可以推迟豚鼠的发病时间。可见，重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1在动物水平对FMDV感染具有较好的保护效果。 本研究构建的重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1在体内体外均能有效抑制FMDV复制与感染，该生物制剂为RNAi防控FMD奠定了基础，具有较大的市场应用价值。