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Keapl(Kelch—likeECH—associatedproteinl)基因的低表达与癌症的发生发展密切相关。DNA甲基化这一表观遗传学机制可引起多种抑癌基因或癌症相关基因的转录失活，那么DNA甲基化是否参与Keapl基因的转录调控，目前尚不清楚。本研究检测了人非小细胞肿癌(non—smallcelllungcancer，NSCLC)细胞系和NSCLC组织中Keapl基因的表达水平及启动子区甲基化状态，探讨Keapl基因甲基化与其基因表达的关系，分析Keapl基因表达调控的分子机制；并从形态学的角度检测Keapl下降后，对其下游分子Nrf2影响及其可能机制，为进一步研究Keapl下调与一些肿瘤的发生发展的关系提供新的实验依据。
材料和方法:
以三种NSCLC细胞系(A549、NCI—H460、SPC—A1)和5例NSCLC组织标本为材料进行下列研究：
1、采用RT-PCR方法和Westernblot法测定NSCLC细胞系和NSCLC组织中Keapl表达水平。
2、应用Methprimer软件，对Keapl基因启动子区进行分析，找出CpG岛，采用亚硫酸氢钠修饰的PCR方法(BSP法)和甲基化特异性PCR(MSP法)对Keapl启动子的甲基化状态进行检测。
3、应用去甲基化药物5—氮杂脱氧胞苷(5—Aza—dC)药物对低表达Keapl的肺癌细胞系进行处理，Real-TimePCR和免疫荧光染色方法检测Keapl表达变化。
4、通过Tfsitescan数据库对结果进行分析，预测影响Keapl表达的转录因子结合位点。
5、运用PCR扩增测序，检测NCI—H460细胞系Keapl启动子P1区的基因序列，观察有无基因序列改变，探讨Keapl表达下降的可能机制。
6、免疫荧光染色检测Keapl降低，对其下游分子Nrf2的影响及其可能机制。
结果:
1、三种NSCLC细胞系(A549、NCI—H460、SPC—A1)和5例NSCLC组织标本中，KeaplmRNA表达水平较人正常支气管上皮细胞系BEAS—2B明显减少。
2、Keapl基因启动子区(—252bp至277bp)存在一个CpG岛。
3、BSP法显示：正常人支气管上皮细胞系BEAS—2B内Keapl基因启动子区CpG岛的P1区域内12个CpG位点呈现低甲基化状态，而NSCLC细胞系和NSCLC组织标本此区域呈现高甲基化状态。
4、MSP法显示：肺癌细胞系A549可同时扩增出M2、U2产物，而其它细胞系和肺癌组织仅扩增出U2产物；在三株肺癌细胞系、两例肺癌标本和BEAS—2B细胞系以及正常人肺组织中均扩增出M1、U1产物，但两者的比率在不同细胞系或组织中有显著差异。
5、5—Aza—dC药物处理后，三种NSCLC细胞系KeaplmRNA的表达呈不同程度增加。
6、Tfsitescan数据分析表明：Keapl基因CpG岛内第3和第10个CpG位点位于Spl的结合域内，第6个CpG位点位于AP2的结合域内。
7、PCR测序未见NCI—H460细胞系中Keapl基因启动子P1区域内基因序列改变。
8、应用过氧化氧处理使细胞内Keapl表达下降，可见Nrf2转移入核，同时可见F—actin解聚现象。
结论:
1、KeaplmRNA在NSCLC细胞系和肺癌组织表达水平明显减少，这种下降与Keapl基因P1区域的高甲基化状态密切相关，提示DNA甲基化参与NSCLC中Keapl基因的表达调控，使其表达下降。
2、推测Keapl基因CpG岛内第3个、第6个和第10个CpG位点分别为转录因子Spl和AP2的结合位点，可能参与Keapl表达的调控。
3、未发现Keapl基因启动子P1区域基因序列的改变。
4、Keapl下降，Nrf2转移入核，这一过程可能与F—actin的解聚有关。