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第一部分:简并PCR探索10种细菌中的水通道蛋白目的:用简并PCR方法扩增幽门螺旋杆菌、绿脓杆菌、乙型副伤寒杆菌、痢疾志贺菌、金黄色葡萄球菌、柠檬色葡萄球菌、白色葡萄球菌、脓肿分枝杆菌、大肠杆菌的水通道蛋白DNA,以探讨这10种细菌是否存在水通道蛋白,为进一步探讨水通道蛋白的生理功能奠定基础。方法:以10种细菌全序列基因组DNA为模板,用细菌水通道蛋白的保守氨基酸序列设计细菌水通道蛋白的简并PCR通用引物,进行简并PCR扩增,将得到的目的片段进行PCR产物纯化、测序;BLAST比较基因序列,判定是否存在细菌水通道蛋白。结果:简并PCR产物纯化、测序后在大肠杆菌中发现410bp大小序列,BLAST证实为水通道蛋白Glp-F。新发现在痢疾志贺菌中存在370bp大小序列,BLAST证实为水通道蛋白Glp-F。在其余8种细菌中未发现类似水通道蛋白的DNA。结论:本试验证实简并PCR能够利用已知的水通道蛋白保守氨基酸序列扩增未知的DNA序列。探索到大肠杆菌存在水通道蛋白Glp-F,与国外报道一致,表明简并PCR能够探索细菌水通道蛋白的存在;新发现痢疾志贺菌中存在细菌水通道蛋白Glp-F,而国外报道在福氏志贺菌中存在细菌水通道蛋白Glp-F,推测志贺菌各群中可能都存在水通道蛋白;本试验的发现为探索水通道蛋白Glp-F生理作用奠定了基础。有8种细菌经简并PCR扩增未得到目的条带,表明水通道蛋白在细菌种群之间的分布存在不均一性。第二部分:高渗透压诱导水通道蛋白Glp-F在痢疾志贺菌内表达目的:用渗透压不同的液体培养基和含有Hg2+(Glp-F选择性抑制剂)的不同渗透压培养基对痢疾志贺菌进行培养,诱导菌体内Glp-F的表达,以探讨Glp-F蛋白在菌体内的生理功能。方法:1.配置不同渗透压培养基:普通牛肉浸液培养基;用无菌水稀释为含1/3、1/2牛肉浸液的培养基;加入NaCl使渗透浓度达到125mM、250mM、500mM、750mM培养基(N-原、N-1/3、N-1/2、N-125mM、N-250mM、N-500mM、N-750mM培养基)。2.配置含有Hg2+抑制剂的不同渗透压培养基:在上述培养基中分别加入Glp-F的功能抑制剂HgCl22mg得到H-原、H-1/3、H-1/2、H-125mM、H-250mM、H-500mM、H-750mM培养基。3.在上述各种培养基中接种痢疾志贺菌,分别于24,48,72,96小时培养点上观察细菌的生长情况,用紫外分光光度计测定其OD600值以评价细菌的生长情况。4.用RT-PCR扩增Glp-F的mRNA,琼脂糖凝胶电泳、染色、成像分析,比较在不同环境条件下生长的痢疾志贺菌Glp-F的mRNA转录量。结果:1.低渗透压环境中培养的痢疾志贺菌在各个观测点的生长无明显差异。2.在N-培养基和H-培养基中生长情况出现显著不同:在H-培养基中细菌生长速度明显低于在N-培养基中生长速度,特别是在125mM、250mM浓度培养基中变化最大。3. RT-PCR显示痢疾志贺菌Glp-F的mRNA含量在普通培养基、稀释1/3、1/2水的牛肉浸液培养基、N-500mM/750Mm、H- N-500mM/750Mm培养基中没有明显差异;在N-125mM /250mM培养基和H-125mM /250mM中含量明显增多,在H-125mM /250mM培养基中,细菌mRNA转录量大于在N-125mM/250mM培养基中的转录量。结论:Glp-F是细菌特有的水通道蛋白,探讨Glp-F的生理功能对研究细菌的水通蛋白有重要意义,国内尚未见报道。本试验的结果可以得到以下结论:1.表达Glp-F蛋白的痢疾志贺菌在低渗透压下生长繁殖速度没有明显变化。2.在高渗透压环境中,痢疾志贺菌的生长繁殖速度随着Glp-F蛋白功能的丧失而降低。3. Glp-F的mRNA的在生长期内有不同的转录,对数生长期内尤为明显,与国外报道相似。4.渗透压的升高能够诱导Glp-F的表达,尤见于N-125mM/250mM和H-125mM /250mM培养基中,并且各种渗透压培养基中水通道蛋白mRNA转录量依次为H-250mM>H-125mM>N-250mM>N-125mM>原始培养基。