【摘 要】
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果胶酶是多种酶的总称,可分为酸性果胶酶和碱性果胶酶,其中的酸性果胶酶广泛应用于果蔬汁的澄清及果酒酿造方面。随着我国果酒果汁行业的发展,其产量已远不能满足食品工业的
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果胶酶是多种酶的总称,可分为酸性果胶酶和碱性果胶酶,其中的酸性果胶酶广泛应用于果蔬汁的澄清及果酒酿造方面。随着我国果酒果汁行业的发展,其产量已远不能满足食品工业的需要。目前国内细菌发酵生产的酸性果胶酶酶活性普遍较低,因此筛选产耐热型酸性果胶酶的细菌菌株,优化其发酵条件等是目前亟待研究的问题。本研究利用碘液法,利用在筛选平板上产生的透明圈进行产果胶酶菌株的初筛,从不同果树下的土壤样品中初筛得到22株能够产生果胶酶的菌株,然后用以果胶作为底物的DNS法进行菌株的复筛,最后得到一株活性较高的菌株(命名为ZJ1407)。经过形态学观察、生理生化鉴定以及16S rDNA分析,该菌株被鉴定为芽孢杆菌属中的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus),其所产的酶的活力最高,为339U/mL。为了提高菌株ZJ1407的酶活,首先通过单因素优化,考察碳源、氮源、无机磷、pH、接种量、装液量和温度等几个对发酵产酶影响较大的因素,筛选出了最适的培养基成分以及最佳培养条件。然后在此基础上,使用响应面法来优化产酶培养基,先采用2-level Factorial实验设计确定三个影响产酶的关键因素:乳糖、蛋白胨和(NH4)2SO4,然后使用Central Composite实验设计对发酵培养基进行响应面优化。经过单因素和响应面法优化分析后,得到最佳发酵培养基配方:乳糖44.8 g/L、蛋白胨 30.9 g/L、(NH4)2SO4 1.35 g/L、MnSO4·H2O 0.2 g/L、MgSO40.4 g/L、NaCI 3.5 g/L,培养条件为:温度 34℃,接种量 8%,pH4.5,装液量50mL(250mL三角锥形瓶)。在此培养条件下,经过48小时达到产酶最高值737.61U/mL,对比优化之前的酶活力338.95U/mL,提高了 54%。在最佳发酵培养的条件下,利用硫酸铵分段盐析,PEG20000浓缩,DEAE-52纤维素离子层析和G-100葡聚糖凝胶过滤层析这四步来分离纯化果胶酶,并对纯化后的蛋白进行酶学性质研究。经过纯化步骤得到纯化倍数为39.49,得率为10.68%的蛋白,该酶蛋白的比活力为69429.51U/mg,分子量约为23kDa。最适的pH和温度为pH5.0和37℃,在pH3.0-6.0之间具有较高的耐受性,在80℃保持120分钟后仍存有初始酶活力的13.3%的酶活性,具有较高的耐热性。5mmol/L浓度的金属离子对其的影响:Ba2+能促进酶作用,Mn2+能够抑制该酶的活性。
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