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研究光信号对真菌发育的影响机制,可为光调控真菌的生命周期以及生长发育、提高代谢产物产量奠定理论基础,对于控制有害真菌或开发有益真菌都具有非常重要的意义。黑曲霉(Aspergillusniger)是外源基因在丝状真菌的重要表达系统,有着重要的生产实践价值。本论文以产糖化酶黑曲霉为材料,研究蓝光下的分生孢子发育的形态变化和生理生化变化规律,考察黑曲霉对光质、光强及照光时间等的反应;采用抑制性消减杂交方法,初步分析了蓝光作用下黑曲霉的部分差异表达基因,研究了蓝光对糖化酶基因、巯基氧化酶、交替氧化酶基因表达的影响。得到以下主要结果:
1.以持续黑暗培养为对照,研究了红光、蓝光下黑曲霉形态发育过程。结果表明,与黑暗对照相比,蓝光处理使菌丝和分生孢子梗粗壮,顶囊显著膨大,分生孢子增大,分生孢子发育提前。黑曲霉在持续黑暗条件下可以形成分生孢子梗并进行正常的孢子发育,但蓝光促进与加快发育进程,尤其是以分生孢子梗形成后以及顶囊初步形成时的黑曲霉(36h-old)对蓝光最敏感。
2.以黑暗为对照,研究了蓝光与红光对黑曲霉产糖化酶及生理生化的影响。结果表明,持续蓝光作用下,还原糖消耗快,黄素类物质合成增加;在产孢阶段,蓝光使糖化酶活力迅速增加,培养3d~4d,蓝光下黑曲霉糖化酶产量最高达660.3U/mL,比黑暗高154﹪;生物量增加了49.48﹪;研究表明:蓝光诱导可以抑制黑曲霉谷氨酰胺-6-磷酸果糖氨基转移酶(GFA)的活性,提高产孢率,蓝光促进与加快分生孢子发育进程;孢子发育和产糖化酶的进程有一定的对应性。分生孢子梗形成后以及顶囊初步形成时的黑曲霉(36h-old)在经蓝光照射后,对提高产孢率和糖化酶产量最为有效;经强光处理的黑曲霉,其产孢率要高于弱光处理的,但对于光调节促进黑曲霉产糖化酶来说,无论是弱光还是强光都具有同样明显的促进作用,黑曲霉能够感应光强度变化,调节其自身代谢和发育进程。研究结果可为在现有水平上应用蓝光调节提高代谢物产量,提供一种新的光诱导模式和思路。
3.以黑暗培养至36h再经蓝光处理4h的菌丝为实验组,对应时间段的黑曲霉菌丝为对照,采用抑制性消减杂交(SSH)方法,构建了蓝光作用下黑曲霉的差异表达基因的eDNA文库。阳性克隆菌落经PCR扩增出大小在200bp左右的差异表达基因的cDNA片段,对其中7个阳性克隆进行序列同源性分析,发现了两个未知功能的差异表达基因;在已知的片段中,同源性最高的是糖化酶(G1,同源性为100﹪)、巯基氧化酶(SOX,同源性为99﹪)和交替氧化酶基因(AOX,同源性为89﹪)。
4.以实时定量PCR分析了3个已知的差异基因片段在蓝光下的表达。结果表明,3个基因在蓝光诱导下表达量均有提高,变化趋势相似:照光后1h表达增加,2h达到高峰,以后表达逐渐降低。其中以交替氧化酶(AOX)同源的基因片段的表达差异最明显,在黑暗中直到40h才‘开始表达,而蓝光照射后1h,表达量就增加。
5.以黑暗培养至36h的黑曲霉菌丝为材料,比较了交替氧化酶专一抑制剂水杨基氧肟酸(SHAM)和激活剂丙酮酸钠以及H202分别对蓝光和黑暗下黑曲霉产孢率的影响。结果表明交替氧化酶一旦受到抑制,蓝光对孢子发育的促进作用受到减弱;在持续黑暗条件下,培养物中H202浓度低于0.5mmol/L时,促进黑曲霉产孢率的提高,而蓝光下H202却始终抑制产孢。