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原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是自身免疫性肝炎中的成员之一，其主要特点以血清中出现高滴度的抗线粒体抗体(antimitochondrialantibody，AMA)、肝内小胆管特异性破坏、肝门脉周围淋巴细胞的浸润等为主。如果治疗不当，最终可以进展为肝硬化，甚至是肝衰竭。虽然在儿童中也有个别PBC的报道，但是其主要还是累及中年女性，男女比例约为1:10。PBC的典型病理表现通常为非化脓性的肉芽肿性胆管炎、汇管区淋巴细胞浸润、小叶间胆管的破坏，可伴有纤维化和/或肝硬化。虽然PBC的研究已有数十载，但是经过FDA认证唯一有效缓解胆汁淤积症状的治疗药物仅为熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic Acid, UDCA)，但它却无法根治该疾病。当疾病进展到晚期，患者往往只能选择肝移植。 至今为止，PBC的具体发病机制还未明确，但是经过那么多年的努力，研究者们普遍认为PBC的发病可能与遗传因素、环境因素以及自身的免疫状态有关。这些因素的共同作用使得机体对自身抗原的耐受性失去平衡，导致肝内小胆管细胞不断受到免疫系统的攻击而造成细胞损伤，从而引起胆汁淤积，最终发病。Shackel NA等人于2001年的研究发现在PBC患者肝细胞的基因表达谱中Hedgehog(Hh)信号通路的膜受体Ptch基因是明显上调的，Jung Y等人于2007年的研究表明，在PBC肝组织中1hh，Ptch，以及Gli2等分子存在过表达的现象，说明Hedgehog信号通路在PBC肝脏病变过程中扮演者十分重要的角色。 Hh信号通路参与多种细胞的增殖、凋亡、迁移以及分化，在胚胎发育以及器官形成的过程中也具有十分重要的作用，它还能够调节多种组织的损伤修复，其中包括肝组织。Hh信号肽包括三种配体:Sonic Hedgehog(Shh)，IndianHedgehog(Ihh)以及Desert Hedgehog(Dhh)。这些Hh配体与细胞膜上的受体Patched(Ptch)结合，可以解除Ptch对膜上另一个分子Smoothened(Smo)的抑制作用，从而可以将信号传播至细胞核内的转录因子Glioblastoma(Gli)，进而调节Gli的靶基因。Gli家族有三种同源基因，分别为Gli1、Gli2和Gli3。Gli1与Gli2主要是转录激活因子，而Gli3则具有抑制转录的功能。在细胞内Hh的前体是在内质网中通过自身催化分裂为具有氨基的Hh-N和具有羧基的Hh-C，其中只有Hh-N具有活性，Hh-N在不同的组织细胞中可以有三种分泌形式，分别为自分泌、旁分泌以及内分泌。 体内有多种细胞因子、生长因子以及炎症因子可以刺激细胞产生Hh配体，例如表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor），转化生长因子(transforming growthfactor-β1，TGF-β1)等。TGF-β1与PBC的关系十分密切，国内外多篇文献包括本实验室也报道了在PBC患者外周血以及肝组织内TGF-β1的表达水平增高，并且与疾病活动程度相关。 基于以上研究，我们提出如下假设:PBC中Hh信号通路中相关分子的异常表达，很有可能对正常人肝细胞有损伤或保护作用。为了证实这个假设，我们以下两个方面进行了研究:(1)检测PBC患者血浆中Shh的表达水平，检测患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC) Hh相关分子的基因及蛋白水平，检测肝组织中Hh蛋白水平;(2)通过体外培养正常入肝细胞（张氏肝细胞，LO-2细胞），通过Shh因子刺激，用CCK-8检测细胞增殖水平，在不同时间点加入不同浓度的Hh信号通路抑制剂（环靶明，GANT61），用CCK-8，流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）检测细胞凋亡水平，用FCM检测细胞周期变化情况，用TGF-β1刺激细胞，检测Hh相关分子基因水平的变化，以初步探索Hh信号通路对肝细胞的功能以及影响Hh分子表达因素。 第一部分、Hedgehog信号通路在PBC中的作用研究 该部分研究的目的是通过检测PBC患者血浆、PBMC以及肝脏中Hh相关分子在基因及蛋白水平的表达，探讨Hh与PBC的关系。我们首先利用RT-PCR技术，检测32例PBC患者、19例慢乙肝患者(HBV)、19例类风湿性关节炎患者(RA)、17例系统性红斑狼疮(SLE)患者、18例多囊肾(PKD)患者以及31例健康对照PBMCHh信号通路相关分子Gli1、Gli2、Ptch的基因及蛋白表达情况;用Elisa检测PBC患者血浆中Shh的分泌情况;用免疫组化的方法检测PBC、HBV患者肝组织中Shh、Gli1、Gli2以及Ptch的表达情况。 结果显示:(1)PBC和HBV患者Gli1 mRNA的表达水平较对照组上调分别为3.90，3.37倍，且差异有统计学意义;Gli2 mRNA水平有升高，但与对照组的差异不明显;PBC患者Ptch mRNA水平上调2.23倍，而HBV患者的Ptch mRNA水平有上调但差异无统计学意义。其他疾病如RA、SLE、PKD等Gli1、Gli2以及Ptch的mRNA水平与对照组之间的差异在统计学上没有明显的意义;(2)用western blot方法检测PBMC中Gli1和Ptch蛋白表达，结果与上述RT-PCR检测结果一致，PBC与HBV患者Gli1与Ptch蛋白水平要明显高于对照组;(3)免疫组织化学结果提示，正常人肝组织中Hh信号分子未出现过表达的现象;PBC患者肝组织汇管区周围的肝细胞有Shh、Gli1、Gli2、Ptch分子阳性表达;HBV患者肝组织中大部分肝实质细胞都存在Shh、Gli1、Gli2、Ptch分子的阳性表达。(4)Elisa检测血浆中Shh配体分泌情况，与健康对照组相比，PBC血浆中Shh水平上调4.1倍，差异有统计学意义;HBV患者Shh水平上调1.98倍，但是统计学差异不明显。上述研究结果表明，Hh信号通路中的相关分子在PBC患者外周血以及肝组织中表达异常增高，说明Hh很可能参与了PBC的发生发展。 第二部分、Hedgehog信号通路参与肝细胞免疫损伤修复研究 第一部分研究中我们发现在PBC患者外周血以及肝组织中Hh信号通路是处于活化状态的，那么该信号通路的激活对PBC患者肝细胞会发挥什么样的作用呢？基于这样的疑问，我们利用张氏肝细胞以及LO-2两种正常人肝细胞来进行实验，首先是利用重组Shh因子刺激细胞，用CCK-8法检测细胞是否能够增殖。然后利用Hh信号通路的特异性抑制剂环靶明（抑制膜Smo受体）和GANT61(抑制Gli)刺激细胞，用CCK-8以及FCM检测细胞凋亡情况，之后用FCM检测细胞周期是否发生变化。 这部分研究中我们发现在两种肝细胞中加入重组Shh后，特别是在72h后细胞有增殖，但是这种增殖似乎与抑制细胞凋亡有关;在加入抑制剂后，我们发现不同浓度不同时间点用环靶明刺激细胞后，细胞变化不明显，而GANT61刺激细胞后，细胞有凋亡的现象。我们用CCK-8和FCM两种方法检测不同浓度GANT61刺激细胞发现，浓度越高，细胞凋亡数量越多;相同浓度，刺激时间越久，细胞凋亡数量越多。从以上结果我们得知20μM GANT61作用细胞后，细胞凋亡明显，因此用该浓度作用细胞后检测细胞周期变化情况。张氏肝细胞实验组G1期比对照组明显下降，而S期和G2期较对照组明显升高，差异有统计学意义;LO-2细胞实验组G1期比对照组下降，差异有统计学意义，S期变化不明显，而G2期较对照组升高，差异有统计学意义。这些结果与CCK-8结果相符，说明加药之后细胞在G2期受阻，细胞增殖能力降低。可见，GANT61能通过影响细胞周期构成而改变细胞特性。 此外在本部分研究中发现环靶明作用效果不明显，猜测是否还有其他因素影响到Gli的表达？通过深入学习，发现TGF-β1与Hh信号通路之间存在一定的联系，因此用重组人TGF-β1刺激两种正常人肝细胞，刺激12h后收集细胞，用RT-PCR检测Gli1和Gli2的表达情况，发现用TGF-β1刺激后Gli1与Gli2的mRNA水平明显升高（张氏肝细胞Gii1上调了1.48倍， Gli2上调了1.27倍，而LO-2细胞中Gli1上调了1.64倍，Gli2上调了1.60倍），差异有统计学意义。这一发现说明，Hh信号通路除了经典激活途径以外，还可通过TGF-β1的一系列相互作用，来促进Gli基因的表达。