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尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase,UGPase)广泛存在于原核与真核生物中。UGPase对植物体内糖的生物代谢有着重要作用。目前水稻中已经成功克隆到两个UGPase基因,分别是位于9号染色体的Ugp1,和位于2号染色体上的Ugp2。通过GenBank和RGP水稻基因数据库进行搜索和分析表明,水稻基因组1号染色体上还有一个预测的UGPase基因,暂称之为Ugp3。NCBI现有的EST数据中还没有OsUgp3相应的EST序列。序列比对结果显示预测的OsUgp3与AtUgp1编码的氨基酸序列相似性较高,而有研究表明AfUgp1易受缺磷,寒冷及其他环境因素影响,因此我们推测OsUgp3可能也受环境因素诱导而表达。基于上述分析,本研究试图根据NCBI上的数据从水稻中克隆预测的Ugp3,研究其表达模式,并与水稻的其他两个家族成员进行比较分析。
用营养液培养粳稻品种中花-11至3叶期,然后进行缺磷7天、缺氮5天以及4℃冷胁迫1、2、3天处理。根据预测OsUgp3与水稻中已克隆的两个UGPase基因家族成员间的比对结果选择特异区段,设计引物npF/R进行扩增。但是缺磷、缺氮处理的样品均无法克隆得到目标序列,只有在冷胁迫处理中花-11粳稻材料中成功并较稳定地克隆到该预测的Ugp3部分序列fragment 1。虽然测序结果与预测mRNA相应区段间只有81.3%同源性,但在NCBI上比对显示水稻中没有找到其他同源性较高的mRNA或者其他基因组区段,表明该预测基因的确是存在并表达的。
虽然尝试了SMARI PCR、反向PCR以及3’RACE等方法,但是都一直无法找到该预测基因的5’和3’端。因此根据预测OsUrp3 mRNA的序列,在fragment 1两端再设计引物,获得了两段分别在3’端和5’比fragment 1更长的序列fragment 2、3,fragment 1重叠在fragment 2,3中。分别在fragment 1,2和3序列中搜索orf,发现其中包含了两个较长的开放阅读框:ORF1(1362bp,不完整无终止密码)及ORF2(612bp,完整),比对分析显示:ORF1编码454个氨基酸,只有前147个氨基酸属于UGPase家族中较保守的区域,推测ORF1编码功能未知蛋白;而fragment 1中的ORF2,其翻译得到的203氨基酸序列与UGPase家族N端序列高度保守,推测ORF2编码产物可能具有UGPase的活性。
此外,通过半定量RT-PCR分析了OsUgp3在不同组织不同时期的表达情况,结果显示该基因总体上表达水平比较低;而根部的表达量明显比叶子高很多;在冷处理第一天的表达量最高,接着第二、第三天便开始减弱。水稻中已克隆的另外两个Ugpase基因家族成员的半定量RT-PCR结果显示:OsUgp1的表达量并不受到缺磷,缺氮和冷处理等环境因素调控,而且它在幼苗及小穗中其表达量基本都一样;而OsUgp2在缺磷,缺氮和冷处理等环境胁迫下也只有微量的提高,主要仍然是在小穗罩表达。