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目前下肢缺血性疾病已经成为危害人类健康的严重疾病之一，针对该疾病的主要治疗手段有药物、外科手术和血管腔内治疗等。但是对于远端流出道严重狭窄的患者目前还缺乏令人满意的治疗方法。应用各种方法和手段促进新生血管生成，加快缺血肢体侧枝循环的建立，是有效可行的研究方向之一。
内皮祖细胞(EPCs)是在特定条件下可以分化成血管内皮细胞的前体细胞，具有促进机体血管生成的功能。1997年，Asahara等从外周血中分离出CD34+细胞，在体外将其诱导分化成内皮细胞，植入动物后肢缺血模型中局部形成新生血管。因而获取EPCs并诱导分化，移植到缺血部位形成新生血管，治疗缺血性疾病如心肌梗死、动脉硬化闭塞症、糖尿病足等引起了人们的广泛兴趣。由于EPCs在体内数量有限，所以如何减少EPCs用量，获得更好的临床效果成为目前研究的重点。
研究表明结合基因治疗是解决这一问题的出路。血管内皮生长因子(VEGF)在治疗缺血性疾病中的作用已经得到肯定，它能增加小血管的通透性、促进内皮细胞增殖和迁移，抑制内皮细胞凋亡，并能刺激内皮细胞产生纤溶酶原激活物，从而有力地促进血管新生。近年来血红素氧合酶-1(HO-1)在血管系统中的作用逐渐被人们所重视，并已成为目前相关领域研究的热点，HO-1蛋白在降低机体缺血时的损伤有重要作用，HO-1可催化血红素形成胆绿素(胆绿素快速还原为胆红素)，释放铁和一氧化碳(CO)，是血红素代谢的限速酶。CO具有调节血管张力、抑制血小板聚集和抗心肌缺血再灌注损伤等效应，胆绿素进一步经胆绿素还原酶作用生成胆红素，其抗氧化能力甚至超过了维生素E和维生素C，能清除体内过量的自由基，保护细胞对抗氧化应激的损伤作用，HO-1降解血红素形成的铁离子还能诱导铁蛋白的合成，铁蛋白亦有抗氧化损伤和细胞保护功能。HO-1及其酶解产物一起组成强大的内源性保护系统，在防治多种心血管疾病中均发挥着积极的作用。近年来在转基因方面取得的进步也表明HO-1是基本的内源性细胞防御系统，具有保持细胞内环境稳定、抗氧化的作用，Melo等发现转染HO-1基因可使结扎冠状动脉后的左室心梗面积缩小75％以上，显示HO-1具有抗心肌缺血坏死的功能。同时其他实验表明HO-1还可促进血管内皮细胞增生，对血管损伤修复有重要作用。
本研究从大鼠骨髓细胞中利用VEGF成功诱导分化成EPCs，并将鼠VEGF和HO-1基因转入EPCs，比较单用EPCs、转染VEGF的EPCs、转染HO-1的EPCs和联合使用转染VEGF和HO-1的EPCs治疗缺血大鼠后肢的效果：
目的：使用VEGF和HO-1转染EPCs治疗大鼠缺血后肢，了解EPCS、VEGF转染EPCS、HO-1转染EPCS及联合使用VEGF和HO-1转染EPCS对大鼠缺血后肢的新生血管和肢体成活的影响，旨在为临床基因与干细胞的治疗应用提供依据。
方法：制作90只SD大鼠后肢缺血模型，将动物随机分为五组，PBS组术后即经鼠尾静脉注射PBS0.2 ml；EPC组术后即经鼠尾静脉注射EPCs悬液0.2 ml；VEGF+EPC组即经鼠尾静脉注射EPCs悬液0.2 ml(其中2.5×105个细胞经VEGF基因转染)；HO-1+EPC组经鼠尾静脉注射EPCs悬液0.2 ml(其中2.5×105个细胞经HO-1基因转染)；VEGF+HO-1+EPC组经鼠尾静脉注射EPCs悬液0.2 ml(其中2.5×105个细胞经VEGF基因转染，2.5×105个细胞经HO-1基因转染)。分别于术后7、14及21d进行有关指标的观察与检测。观察转染VEGF、HO-1基因的EPCs在缺血部位的聚集和促进新生血管形成的情况。
结果：1)用密度梯度离心和贴壁法结合VEGF细胞因子体外培养的骨髓来源的EPCs为CD133、CD34阳性细胞，表达VEGFR—2，FITC—UEA-1双荧光染色阳性；2)鼠VEGF、HO-1基因测序鉴定结果分别与参考序列NM_031836和NM012580一致，并成功转染入EPCs；3)动物总残肢率比较，VEGF、HO-1和VEGF+HO-1组较PBS组明显增加的肢体恢复率(P<0.05)，其中VEGF组和HO-1组之间差异无统计学意义(P>0.05)；VEGF+HO-1组肢体恢复率优于VEGF组和HO-1组，差异有统计学意义(P<0.05)。4)毛细血管密度(MVD)与PBS组相比，各时间点中EPC、VEGF、HO-1和VEGF+HO-1组MVD均明显增多(P<0.05)，手术后14d和21d，VEGF+HO-1组MVD多于VEGF组和HO-1组，差异有统计学意义(P<0.05)：5)缺血肢体VEGF，HO-1的表达：VEGF组的VEGF蛋白表达较PBS组、EPC组、HO-1组明显增多，与VEGF+HO-1组差异无统计学意义；HO-1组的HO-1蛋白表达较PBS组、EPC组、VEGF组明显增多，与VEGF+HO-1组差异无统计学意义；6)手术后7d，所有组的小鼠肢体灌注都降低：手术后14，21d，与PBS对照组相比，VEGF、HO-1和VEGF+HO-1组的血流灌注恢复明显(P<0.01)，EPC组血流灌注较VEGF组和HO-1组少，差异有统计学意义(P<0.05)；VEGF+HO-1组血流灌注多于VEGF组和HO-1组，差异有统计学意义(P<0.05)。
结论：用密度梯度离心和贴壁法结合VEGF细胞因子培养大鼠骨髓干细胞可以获得较高纯度的EPCs；VEGF基因转染EPCs对缺血部位的血管新生有重要影响；HO-1可促进缺血局部的毛细血管的增生，延缓或阻止肢体坏死；联合应用EPCs、VEGF和HO-1基因治疗缺血后肢有很好的协同作用。