论文部分内容阅读
脊椎动物胚胎发育的分子机理是发育生物学的最复杂最重要的问题之一。斑马鱼作为脊椎动物发育研究模式生物，本身具有独特的优越性：短的世代周期；高的繁殖率；透明胚的快速的体外发育。今天在斑马鱼研究领域已发展了丰富的研究技术，使得斑马鱼在揭示脊椎动物胚胎发育的分子机理方面占据日益重要的地位。
我们已知，在中期囊胚转换(合子基因组启动)之前，所有的卵成熟和胚胎发育过程是由母体产物驱动的。即使在合子基因组启动之后，那些持久存在的母体因子，或同其它的母体因子一起，或通过和新表达的合子产物相互作用，继续施行其发育所必需的生物学功能。
从上所述，对斑马鱼早期胚胎发育涉及到的复杂的母体因子分子网络，其中的关键因子以及它们在发育调控的信号通路中的相互作用理清之后，则有望揭示斑马鱼早期胚胎发育的分子机理。对于早期胚胎发生期间参与细胞命运决定的主要通路(尤其是背腹模式形成中的通路)的认识已取得重大进展，但这些通路中的许多关键因子及其相互作用仍亟待进一步探索。所以本研究旨在鉴定并克隆新的或功能未知的母体因子，并探寻它们在斑马鱼胚胎发育中的生物学功能。
本研究采用基于PCR的减法杂交策略，结合菌落杂交和菌落PCR来筛选成熟卵母细胞中的母体基因。首次在卵母细胞中克隆到一个新的母体基因Rap2ip，其在斑马鱼胚胎发育中的生物学功能前人未有研究。于是将基因Rap2ip定为研究重点。首先克隆其全长CDS，进而通过RT-PCR-Southern、原位杂交、亚细胞定位、反义RNA抑制、反义Oligo抑制实验和生物信息学分析来探寻它的表达图式及在斑马鱼胚胎发育中的生物学功能。
对Rap2ip进行了生物信息学分析。结果表明Rap2ip无DNA-bindingmotif，无RNA-bindingmotif和ribosomalproteinmotif，由此推测Rap2ip的生物学功能，是通过与靶蛋白的相互作用来实现的。斑马鱼Rap2ip是一个在进化上相对保守的基因。Rap2ip含一个RUNdomain。已知RUNdomain在与Rap和Rab家族的GTPases的功能相关的几种蛋白中出现，参与到Ras-likeGTPase信号通路。
RT-PCR-Southern结果显示：Rap2ip在斑马鱼早期发育过程中既有母源表达，又有合子型表达。Rap2ip在卵母细胞中呈高表达。Rap2ipmRNA的量从12hpf开始下降，到36hpf表达又开始上升。原位杂交结果显示：Rap2ipmRNA在成熟卵母细胞中定位到一极；从卵裂期到原肠期Rap2ipmRNA是均匀分布在胚胎组织中的；24-hpf胚呈现三点高表达，分别为头部、体轴中部和尾部；在48-hpf胚则是集中在后2/3段体轴表达；在60-hpf胚表达部位又沿体轴向前延伸，遍布整个体轴。综上，Rap2ipmRNA表达所呈现出的时空差异性，表明基因Rap2ip无论是作为一个母体基因，还是作为一个合子基因，都有着其复杂的生物学功能。另外，亚细胞定位实验结果显示Rap2ip在胞质表达，说明Rap2ip蛋白产物是一个胞质因子。
Rap2ip反义RNA抑制实验结果显示，反义RNA注射的胚胎发育较正常对照要延迟。在发育到胚盾期(6hpf)以前存活胚胎中绝大部分发生皱缩，形状不规则，这些畸形胚胎绝大部分最终要死亡；有些胚胎卵黄延伸明显较正常胚胎缩短，后半部分体轴及尾部发育严重缺陷，且腹部膨大。Rap2ip反义Oligo抑制实验结果显示，由于反义Oligo注射抑制了Rap2ip母体mRNA的翻译而导致了胚胎发育前期(1hpf～9hpf)高的死亡率，由此推测母体因子Rap2ip的功能完全缺失具有胚胎致死效应；后期胚胎发育缺陷主要表现为：从卵黄延伸起始处体轴发育严重缺陷，呈截断状，且卵黄延伸几乎没有；或体轴不规则弯曲；腹部膨大。我们初步认为Rap2ip蛋白产物参与到斑马鱼胚胎体轴的形成和发育，并且可能是胚胎体轴发育的一个正调控因子。另一方面，反义RNA抑制和反义Oligo抑制均导致腹部膨大，我们推测Rap2ip也可能是斑马鱼胚胎腹部发育的一个负调控因子。