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银屑病是一种常见的慢性复发性炎症性皮肤病,在自然人群中的发生率为0.1%-0.3%,我国近年来有逐渐增高的趋势。随着Th17细胞在银属病发生、发展过程中的作用的认识不断深入,为研究银屑病的发病机制及治疗开辟了新思路。由于西药治疗的各种副作用,使临床治疗不甚满意。而中药有不可替代的优势,其中凉血活血方是临床治疗银屑病的有效方裁。本课题通过制备及验证由咪喹莫特诱导的以Th17通路参与的银屑病样小鼠模型,选取适合的药物作用时间窗,观察凉血活血胶囊对该模型的干预作用,以阐明凉血活血方的作用靶点,为临床应用提供理论依据。
方法:
1.咪喹莫特诱导银屑病样小鼠模型的制备及验证:BALB/c雄性小鼠30只,麻醉后背部备皮(2cm×3cm),随机分为对照组(灌服生理盐水、外涂凡士林),模型组(灌服生理盐水、外涂4%咪喹莫特乳膏42mg),甲氨蝶呤组(1mg/Kg浓度甲氨蝶呤溶液灌胃、外涂咪喹莫特乳膏同模型组),连续6d制备模型。采用银屑病皮损面积和疾病严重程度评分标准观察模型皮损情况。取材后光镜下观察皮损组织学变化,测量表皮层厚度;免疫组织化学法检测增殖细胞核抗原反映表皮角质形成细胞增殖程度,检测皮损中CD3、CD11c、F4/80和Gr-1反映炎症细胞浸润程度,检测CD31反映血管增生;计算脾指数(脾重/体重);细胞因子抗体芯片技术初步筛选皮损组织与血清中细胞因子的变化。
2.咪喹莫特诱导银屑病样小鼠模型的动态观测:BALB/c雄性小鼠84只,随机分为对照组、长期给药组、短期给药组,同上制备模型,观察各组皮损变化规律(长期给药14d,短期给药6d)。分别于2d、4d、6d、8d、lod、12d、14d取材,观察上述指标变化,并采用Western、Blot方法检测皮损组织中Th17相关细胞因子的蛋白表达。
3.凉血活血胶囊对银屑病样小鼠模型的干预作用:BALB/c雄性小鼠60只,随机分为对照组、模型组、凉血活血胶囊高、中、低剂量组(2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg)、雷公藤多苷组(10mg/Kg),连续14d同上制备模型。各组取6只小鼠8d后取材,观察凉血活血胶囊对上述指标的影响。
结果:
1.咪喹莫特诱导银屑病样小鼠模型的制备及验证:PASI评分明显高于对照小鼠;病理变化与银屑病改变相似:光镜下模型小鼠皮肤表皮层增厚,约为对照组8-10倍(P＜0.05),角化不全,棘层增厚,Munro微脓肿真皮大量炎症细胞(T淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和单核细胞)浸润,浅层血管增生扩张;脾指数增加(P＜0.05);皮损组织和血清中GM-CSF和IL-17等细胞因子明显升高;通过甲氨蝶呤治疗为阳性对照,显示出拮抗作用。
2.咪喹莫特诱导银屑病样小鼠模型的动态观测:连续观察14d,长期给药组小鼠涂药1d后皮肤即出现点状红斑,2-3d后如现细小碎屑,增厚倾向。红斑由少量淡粉色变为大面积深红色,鳞屑由少量细屑过渡至布满全暴露皮肤的层状鳞屑,皮肤增厚、隆起,7、8d最为严重,此后红斑缓缓消退,鳞屑快速脱落,增厚情况减退缓慢,14d时红斑及鳞屑已基本消退,增厚明显缓解,但三者始终明显高于正常;短期给药组自停药后红斑及鳞屑迅速消退,增厚的减退稍慢,接近对照水平;组织化学染色和Western Blot检测发现皮损组织形态学变化、表皮厚度改变、角质形成细胞增殖、T淋巴细胞浸润及Th17类因子(IL-1β、IL-17、IL-23、p-Tyk2、p-Stat3)的分泌的改变都呈现逐渐升高,到达峰值后逐渐降低的变化规律。
3.凉血活血胶囊对银屑病样小鼠模型的干预作用;凉血活血胶囊治疗后小鼠银屑病样皮损症状明显缓解,PASI分数降低,凉血活血胶囊组高、中剂量可降低表皮层垂直厚度(P＜0.05),角化不全减轻,角质形成细胞增殖减少,T淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和单核细胞在真皮浸润减少,新生血管减少,另外高、中剂量可降低皮肤组织中IL-17、Il-23蛋白的表达。
结论:
咪喹莫特诱导小鼠产生的皮损症状、病理学特征及细胞因子改变都与人类银屑病十分相似,前8d为疾病的发展阶段,6d-8d为变化高峰。凉血活血胶囊可明显改善动物模型症状、细胞增殖状态、炎症细胞浸润和血管扩张新生,其可能通过抑制免疫系统激活,特别是Th17相关通路的作用,发挥了对咪喹莫特诱导的银屑病样动物模型的治疗作用,提示凉血活血胶囊作用于免疫异常活化环节,可能是其临床治疗银屑病的作用机制之一。