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伴侣蛋白Chaperonin60(Cpn60)参与了许多叶绿体蛋白质多肽的折叠，在光合作用中起着至关重要的作用。在叶绿体中，Cpn60分为Cpn60α和Cpn60β两个区别明显的亚基类型。水稻Cpn60家族有3个α亚基和3个β亚基，但其作用机理却知之甚少。前期的研究发现OsCpn60β1在水稻高温胁迫和盐胁迫中发挥着极为重要的作用，但其调控光合作用的机制还不清楚。我们利用CRISPR/Cas9技术将水稻OsCpn60β1进行编辑，获得了纯合的OsCpn60β1敲除突变体株系。本研究中，通过对突变体的表型分析，并运用植物生理和分子生物学的手段，研究了OsCpn60β1调控光合作用的机制。主要研究结果如下：
(1)oscpn60β1突变体呈现叶片白化且三叶期致死的表型。oscpn60β1突变体中叶绿素和类胡萝卜素含量显著下调，与其表型一致。突变体发育迟缓，株高和鲜重明显低于野生型。此外，功能互补实验表明，oscpn60β1突变体的表型是由OsCpn60β1的缺失所引起。
(2)OsCpn60β1对叶绿体的发育至关重要。光合参数和叶绿素荧光测定发现，oscpn60β1突变体中PSII和PSI的光化学效率(ФPSII和ФPSI)均显著降低，净光合速率Pn的值为负数。此外，叶绿体透射电镜观察发现，oscpn60β1突变体叶肉细胞中不能形成正常的叶绿体。
(3)oscpn60β1突变体中光合作用相关通路及核糖体通路蛋白表达发生显著变化。利用label-free定量蛋白质组学，分析比较oscpn60β1突变体与野生型中存在的差异表达蛋白。结果发现在突变体和野生型中共鉴定到3534个蛋白。与野生型相比，突变体中共有558个差异表达蛋白，包括277个表达上调蛋白和281个表达下调蛋白。并对差异表达蛋白进行GO和KEGG功能富集分析，发现突变体中一些差异蛋白在乙醛酸和二羧酸代谢、捕光天线蛋白和光合作用等三条代谢通路中被显著富集，表明OsCpn60β1与这三条富集的代谢通路关系最为紧密。此外，一些核糖体蛋白尤其是叶绿体核糖体蛋白显著下调，突变体中16SrRNA和23SrRNA缺失，说明oscpn60β1突变体中叶绿体核糖体的合成受阻。
(4)OsCpn60β1与AtpB存在相互作用。利用酵母双杂交和荧光酶互补实验进一步验证了OsCpn60β1与AtpB之间的相互作用。此外，Westernblot检测发现oscpn60β1突变体中AtpB的蛋白几乎检测不到，且突变体中类囊体电导率显著降低。这些结果表明，OsCpn60β1可能直接参与了AtpB的折叠过程，进而影响AtpB蛋白的积累及叶绿体ATP合酶的活性。
(5)OsDof24转录因子负调控OsCpn60β1的表达。酵母单杂交实验发现OsDof24转录因子可以与OsCpn60β1启动子相结合。双荧光素酶报告实验表明OsDof24可以抑制OsCpn60β1启动子的活性。qRT-PCR检测发现OsDof24过表达株系中OsCpn60β1的表达显著下调。该结果表明OsDof24转录因子可以直接结合在OsCpn60β1的启动子上，并抑制了OsCpn60β1的转录表达。
综上所述，OsCpn60β1调控水稻光合作用的机制主要是通过影响叶绿体核糖体蛋白的表达、光合反应中心相关蛋白和AtpB亚基减少等导致叶绿体发育不良。而OsCpn60β1也受到OsDof24转录因子负调节。上述结果为植物Cpn60家族功能的进一步研究提供了新线索。
(1)oscpn60β1突变体呈现叶片白化且三叶期致死的表型。oscpn60β1突变体中叶绿素和类胡萝卜素含量显著下调，与其表型一致。突变体发育迟缓，株高和鲜重明显低于野生型。此外，功能互补实验表明，oscpn60β1突变体的表型是由OsCpn60β1的缺失所引起。
(2)OsCpn60β1对叶绿体的发育至关重要。光合参数和叶绿素荧光测定发现，oscpn60β1突变体中PSII和PSI的光化学效率(ФPSII和ФPSI)均显著降低，净光合速率Pn的值为负数。此外，叶绿体透射电镜观察发现，oscpn60β1突变体叶肉细胞中不能形成正常的叶绿体。
(3)oscpn60β1突变体中光合作用相关通路及核糖体通路蛋白表达发生显著变化。利用label-free定量蛋白质组学，分析比较oscpn60β1突变体与野生型中存在的差异表达蛋白。结果发现在突变体和野生型中共鉴定到3534个蛋白。与野生型相比，突变体中共有558个差异表达蛋白，包括277个表达上调蛋白和281个表达下调蛋白。并对差异表达蛋白进行GO和KEGG功能富集分析，发现突变体中一些差异蛋白在乙醛酸和二羧酸代谢、捕光天线蛋白和光合作用等三条代谢通路中被显著富集，表明OsCpn60β1与这三条富集的代谢通路关系最为紧密。此外，一些核糖体蛋白尤其是叶绿体核糖体蛋白显著下调，突变体中16SrRNA和23SrRNA缺失，说明oscpn60β1突变体中叶绿体核糖体的合成受阻。
(4)OsCpn60β1与AtpB存在相互作用。利用酵母双杂交和荧光酶互补实验进一步验证了OsCpn60β1与AtpB之间的相互作用。此外，Westernblot检测发现oscpn60β1突变体中AtpB的蛋白几乎检测不到，且突变体中类囊体电导率显著降低。这些结果表明，OsCpn60β1可能直接参与了AtpB的折叠过程，进而影响AtpB蛋白的积累及叶绿体ATP合酶的活性。
(5)OsDof24转录因子负调控OsCpn60β1的表达。酵母单杂交实验发现OsDof24转录因子可以与OsCpn60β1启动子相结合。双荧光素酶报告实验表明OsDof24可以抑制OsCpn60β1启动子的活性。qRT-PCR检测发现OsDof24过表达株系中OsCpn60β1的表达显著下调。该结果表明OsDof24转录因子可以直接结合在OsCpn60β1的启动子上，并抑制了OsCpn60β1的转录表达。
综上所述，OsCpn60β1调控水稻光合作用的机制主要是通过影响叶绿体核糖体蛋白的表达、光合反应中心相关蛋白和AtpB亚基减少等导致叶绿体发育不良。而OsCpn60β1也受到OsDof24转录因子负调节。上述结果为植物Cpn60家族功能的进一步研究提供了新线索。