论文部分内容阅读
丁醇不仅是重要的有机化工原料和化学溶剂，而且作为一种优质的液体燃料，具有比燃料乙醇更高的经济实用性，是未来替代汽油的最佳选择之一。传统的ABE发酵以玉米、糖蜜等为发酵底物，存在成本高并“与人争粮”的问题。近年来生物质能源的蓬勃发展使木质纤维素水解工艺逐渐成熟，木质纤维素水解液ABE发酵得到了广泛的关注。目前，已经有多种纤维素原料如:玉米芯/杆、柳枝稷、小麦杆、水稻杆等，但局限于酶水解效率低成本高、酸水解抑制物多未能实现纤维素丁醇工业化生产。本文从研究培养基组分及发酵规律出发，结合菌种改造以提高溶剂产率，以期达到降低生产成本的目的，同时考虑丁醇废水的处理方法，解决本工艺产业化过程中的环保问题，为纤维素丁醇工业化生产提供基础。
首先研究了不同氮源对ABE发酵的影响。考察了工业上常用的发酵氮源物质玉米浆干粉对ABE发酵的影响。发现玉米浆干粉可用于淀粉类原料及葡萄糖、木糖ABE发酵，其pH适应范围广，为5-7.5，添加微量元素硫酸铵对其发酵没有明显改善。葡萄糖、木糖及混合糖发酵生产ABE转化率均能达到30％以上，但用于玉米芯酸水解液发酵时不能生长，有可能是因为硫酸根离子过量。豆粕作为廉价氮源添加物可用于ABE发酵，以6g/L豆粕为氮源，初始糖浓度为50g/L的葡萄糖ABE发酵48h结束，总溶剂15.02g/L，总溶剂产率0.29，生产强度0.31g/(L·h)。考察了额外添加无机氮源硫酸铵、乙酸铵对ABE发酵的影响，结果与文献报道不同，添加硫酸铵、乙酸铵对ABE发酵均有严重的抑制作用。
其次研究了不同碳源对ABE发酵的影响。对于不同的碳源物质，纤维二糖、葡萄糖、木糖的ABE发酵总溶剂产率依次增大，初始糖浓度为50g/L、60g/L时，葡萄糖总溶剂产率比木糖高9％左右，纤维二糖较木糖高40％，生产强度葡萄糖较木糖高94％。80g/L葡萄糖ABE发酵没有明显底物抑制作用，70g/L木糖、80g/L纤维二糖ABE发酵出现严重的底物抑制作用。另外，无底物抑制情况下，纤维二糖ABE转化率较其他两种糖高。葡萄糖、木糖混合ABE发酵，木糖占总糖比例为20％时，葡萄糖代谢阻遏效应明显;木糖所占比例为60％和80％时，葡萄糖代谢阻遏效应较轻。葡萄糖、木糖、纤维二糖混合发酵总溶剂产率高于单糖发酵，因此木质纤维素同步酶水解ABE发酵工艺从理论上是可以实现的。
再次研究了不同影响因子对ABE发酵的影响。考察了添加微量元素硫酸镁、磷酸氢二钾对ABE发酵的影响。添加0.2g/L硫酸镁时总溶剂产率0.32，较对照组提高7％左右。而添加0.25～0.75g/L磷酸氢二钾葡萄糖ABE发酵溶剂产量略有降低。以6g/L豆粕为氮源，初始糖浓度为50g/L的玉米芯酸水解液ABE发酵96h结束，总溶剂12.43g/L，产率0.28，生产强度0.13g/(L·h)。混合糖参照组发酵72h结束，总溶剂13.33g/L，产率0.31，生产强度0.19g/(L·h)。表明玉米芯酸水解液中存在抑制ABE发酵的因子。以6g/L豆粕为氮源，初始糖浓度为60g/L玉米芯酶水解液ABE发酵60h结束，总溶剂16.66g/L，产率0.3，生产强度0.28g/(L·h)。以模拟玉米芯酶水解液糖组成的混合糖ABE发酵为参照组发酵72h结束，总溶剂17.12g/L，产率0.3，生产强度0.24g/(L·h)。表明玉米芯酶水解液中可能存在促进ABE发酵的因子。0.2～2g/L5-羟甲基糠醛对ABE发酵有明显抑制。玉米芯酸水解液脱毒后残余的0.32g/L5-羟甲基糠醛是玉米芯水解液中存在的主要抑制因子。0.2g/L糠醛对ABE发酵有微弱的促进作用，乙醇产量明显提高，大于0.2g/L糠醛对ABE发酵有明显的抑制作用。添加中间代谢物乙酸能够明显提高丙酮产量，丁醇产量略有提高但影响不大。添加丁酸能够同时提高丁醇、丙酮产量，但效果不明显。考察了发酵产物乙醇、丙酮、丁醇对菌种的反馈抑制作用，ABE溶剂对发酵的反馈抑制由强至弱依次是丁醇、丙酮、乙醇。45g/L乙醇对ABE发酵有明显的抑制，而这种较强抑制丙酮为30g/L、丁醇为5g/L。此菌种ABE发酵能耐受的最高丁醇浓度为15.66g/L。结果表明三种产物对丙酮丁醇梭菌细胞的毒害作用丁醇最强，乙醇毒害作用最小。
此外还构建了ABE基因工程菌，对ABE的代谢进行了调节。通过重叠PCR共表达了来源于C.acetobutyliumATCC43084的hbd、thl、crt、bcd基因以及sol操纵子的adhE、ctfAB基因，构建出重组质粒pIMP1、pIMP1-EC、pIMP1-Sol、pIMP1-Sol-EC，进行甲基化修饰后转化至C.acetobutyliumATCC824，获得重组菌株C.acetobutylicumATCC824pIMP1,C.acetobutylicumATCC824pIMP1-Sol,C.acetobutylicumATCC824pIMP1-EC,C.acetobutylicumATCC824pIMP1-Sol-EC。将重组菌进行分批发酵，考察发酵动力学，重组菌株的最大DCW和最大比生长速率接近，所有菌株24h即进入稳定期。共表达ABE合成基因对重组菌株的菌体生长影响很小，但合成溶剂能力明显提高。与C.acetobutylicumATCC824pIMP1较低的比丁醇生产速率0.045g/(g·L)-1相比，C.acetobutylicumATCC824pIMP1-Sol的比丁醇生产速率提高到0.061g/(g·L)-1，C.acetobutylicumATCC824pIMP1-EC的比丁醇生产速率提高到0.078g/(g·L）-1，C.acetobutylicumATCC824pIMP1-Sol-EC的比丁醇生产速率提高到0.088g/(g·L)-1。共表达ABE合成基因获得了高的代谢速率。构建了adc基因失活gshAB基因表达的菌株，命名为C.acetobutylicumATCC824adc::gsh。与对照C.acetobutylicumATCC824ABE产量分别为2.638、5.026、0.806g/L相比，C.acetobutylicumATCC824adc::gshABE产量分别为2.432、9.865、1.885g/L。醇的产量提高，丙酮产量下降，表明adc基因失活gshAB基因表达可以降低丙酮代谢的速率提高乙醇丁醇的产量。
最后以丁醇废水的处理为出发点，创造性的提出了利用丁醇废水生产微生物油脂，实验证明无需任何预处理以及添加营养物质（氮源与微量元素），ABE发酵废水即可作为新型油脂酵母T.dermatis与T.coremiiforme发酵的理想底物，发酵后COD去除率达68％以上。废水中的残糖与有机酸都能被利用，但两株菌对其利用规律存在差异:T.coremiiforme对糖与有机酸的利用能力要略优于T.dermatis。且发酵过程中油脂酵母的脂肪酸组成会发生一定的改变，但上述两株酵母所产的微生物油脂均适合作为生物柴油的理想原料。本思路的提出既解决了纤维素丁醇废水处理的环保问题，又创造新的经济效益。
首先研究了不同氮源对ABE发酵的影响。考察了工业上常用的发酵氮源物质玉米浆干粉对ABE发酵的影响。发现玉米浆干粉可用于淀粉类原料及葡萄糖、木糖ABE发酵，其pH适应范围广，为5-7.5，添加微量元素硫酸铵对其发酵没有明显改善。葡萄糖、木糖及混合糖发酵生产ABE转化率均能达到30％以上，但用于玉米芯酸水解液发酵时不能生长，有可能是因为硫酸根离子过量。豆粕作为廉价氮源添加物可用于ABE发酵，以6g/L豆粕为氮源，初始糖浓度为50g/L的葡萄糖ABE发酵48h结束，总溶剂15.02g/L，总溶剂产率0.29，生产强度0.31g/(L·h)。考察了额外添加无机氮源硫酸铵、乙酸铵对ABE发酵的影响，结果与文献报道不同，添加硫酸铵、乙酸铵对ABE发酵均有严重的抑制作用。
其次研究了不同碳源对ABE发酵的影响。对于不同的碳源物质，纤维二糖、葡萄糖、木糖的ABE发酵总溶剂产率依次增大，初始糖浓度为50g/L、60g/L时，葡萄糖总溶剂产率比木糖高9％左右，纤维二糖较木糖高40％，生产强度葡萄糖较木糖高94％。80g/L葡萄糖ABE发酵没有明显底物抑制作用，70g/L木糖、80g/L纤维二糖ABE发酵出现严重的底物抑制作用。另外，无底物抑制情况下，纤维二糖ABE转化率较其他两种糖高。葡萄糖、木糖混合ABE发酵，木糖占总糖比例为20％时，葡萄糖代谢阻遏效应明显;木糖所占比例为60％和80％时，葡萄糖代谢阻遏效应较轻。葡萄糖、木糖、纤维二糖混合发酵总溶剂产率高于单糖发酵，因此木质纤维素同步酶水解ABE发酵工艺从理论上是可以实现的。
再次研究了不同影响因子对ABE发酵的影响。考察了添加微量元素硫酸镁、磷酸氢二钾对ABE发酵的影响。添加0.2g/L硫酸镁时总溶剂产率0.32，较对照组提高7％左右。而添加0.25～0.75g/L磷酸氢二钾葡萄糖ABE发酵溶剂产量略有降低。以6g/L豆粕为氮源，初始糖浓度为50g/L的玉米芯酸水解液ABE发酵96h结束，总溶剂12.43g/L，产率0.28，生产强度0.13g/(L·h)。混合糖参照组发酵72h结束，总溶剂13.33g/L，产率0.31，生产强度0.19g/(L·h)。表明玉米芯酸水解液中存在抑制ABE发酵的因子。以6g/L豆粕为氮源，初始糖浓度为60g/L玉米芯酶水解液ABE发酵60h结束，总溶剂16.66g/L，产率0.3，生产强度0.28g/(L·h)。以模拟玉米芯酶水解液糖组成的混合糖ABE发酵为参照组发酵72h结束，总溶剂17.12g/L，产率0.3，生产强度0.24g/(L·h)。表明玉米芯酶水解液中可能存在促进ABE发酵的因子。0.2～2g/L5-羟甲基糠醛对ABE发酵有明显抑制。玉米芯酸水解液脱毒后残余的0.32g/L5-羟甲基糠醛是玉米芯水解液中存在的主要抑制因子。0.2g/L糠醛对ABE发酵有微弱的促进作用，乙醇产量明显提高，大于0.2g/L糠醛对ABE发酵有明显的抑制作用。添加中间代谢物乙酸能够明显提高丙酮产量，丁醇产量略有提高但影响不大。添加丁酸能够同时提高丁醇、丙酮产量，但效果不明显。考察了发酵产物乙醇、丙酮、丁醇对菌种的反馈抑制作用，ABE溶剂对发酵的反馈抑制由强至弱依次是丁醇、丙酮、乙醇。45g/L乙醇对ABE发酵有明显的抑制，而这种较强抑制丙酮为30g/L、丁醇为5g/L。此菌种ABE发酵能耐受的最高丁醇浓度为15.66g/L。结果表明三种产物对丙酮丁醇梭菌细胞的毒害作用丁醇最强，乙醇毒害作用最小。
此外还构建了ABE基因工程菌，对ABE的代谢进行了调节。通过重叠PCR共表达了来源于C.acetobutyliumATCC43084的hbd、thl、crt、bcd基因以及sol操纵子的adhE、ctfAB基因，构建出重组质粒pIMP1、pIMP1-EC、pIMP1-Sol、pIMP1-Sol-EC，进行甲基化修饰后转化至C.acetobutyliumATCC824，获得重组菌株C.acetobutylicumATCC824pIMP1,C.acetobutylicumATCC824pIMP1-Sol,C.acetobutylicumATCC824pIMP1-EC,C.acetobutylicumATCC824pIMP1-Sol-EC。将重组菌进行分批发酵，考察发酵动力学，重组菌株的最大DCW和最大比生长速率接近，所有菌株24h即进入稳定期。共表达ABE合成基因对重组菌株的菌体生长影响很小，但合成溶剂能力明显提高。与C.acetobutylicumATCC824pIMP1较低的比丁醇生产速率0.045g/(g·L)-1相比，C.acetobutylicumATCC824pIMP1-Sol的比丁醇生产速率提高到0.061g/(g·L)-1，C.acetobutylicumATCC824pIMP1-EC的比丁醇生产速率提高到0.078g/(g·L）-1，C.acetobutylicumATCC824pIMP1-Sol-EC的比丁醇生产速率提高到0.088g/(g·L)-1。共表达ABE合成基因获得了高的代谢速率。构建了adc基因失活gshAB基因表达的菌株，命名为C.acetobutylicumATCC824adc::gsh。与对照C.acetobutylicumATCC824ABE产量分别为2.638、5.026、0.806g/L相比，C.acetobutylicumATCC824adc::gshABE产量分别为2.432、9.865、1.885g/L。醇的产量提高，丙酮产量下降，表明adc基因失活gshAB基因表达可以降低丙酮代谢的速率提高乙醇丁醇的产量。
最后以丁醇废水的处理为出发点，创造性的提出了利用丁醇废水生产微生物油脂，实验证明无需任何预处理以及添加营养物质（氮源与微量元素），ABE发酵废水即可作为新型油脂酵母T.dermatis与T.coremiiforme发酵的理想底物，发酵后COD去除率达68％以上。废水中的残糖与有机酸都能被利用，但两株菌对其利用规律存在差异:T.coremiiforme对糖与有机酸的利用能力要略优于T.dermatis。且发酵过程中油脂酵母的脂肪酸组成会发生一定的改变，但上述两株酵母所产的微生物油脂均适合作为生物柴油的理想原料。本思路的提出既解决了纤维素丁醇废水处理的环保问题，又创造新的经济效益。