论文部分内容阅读
当前，猪病对养猪生产的影响是有增无减，其中病毒病占引起猪死亡病例数的60％以上。猪病毒病因为危害大、传播快、无有效治疗药物，加上容易发生严重的混合感染和继发感染，给及时准确地诊断和监测带来很大的困难，给养殖业带来巨大的经济损失。近几年来，猪瘟(CSF)、猪蓝耳病(PRRS)、口蹄疫(FMD)、猪流行性腹泻(PED)的暴发和流行情况表明，对这些疾病的监测、早期诊断是做好预防控制工作的重要前提。 建立方法的准确性直接关系到检测结果的准确性，有效的检测方法是疫病防控的必要手段。随着病毒分子生物学的发展及其在诊断和防控上的应用，荧光定量PCR检测技术因具有较好的准确性、敏感性、特异性和重复性备受医学诊断的认可和应用，而其在兽医方面，如猪瘟、猪蓝耳病、口蹄疫、猪流行性腹泻等重大疫病方面的应用研究还不足，不能满足当前我国重大猪病防治的需要。因此，本论文针对CSFV、FMDV、PRRSV、PEDV建立适合临床应用的荧光定量TaqMan MGB探针PCR检测方法，以期形成相应的检测试剂盒。 本研究的第一部分，针对CSFV从引物和荧光探针合成与结构分析、扩增体系条件优化、RNA提取以及检测上下限、符合率、特异性、稳定性和临床检测验证等方面进行研究，成功地建立CSFV TaqMan MGB探针荧光定量RT-PCR检测方法。用于检测临床样本的CSFV，与传统的普通PCR方法检测血清中CSFV抗原结果的比较，该方法特异性强、灵敏度高、稳定性好，而且操作方便，简化了操作步骤，避免了样本间的交叉污染；同时缩短了检测时间，定量检测上下限分别为107拷贝/μL和102拷贝/μL，该方法所用的四个标准品梯度批内的变异系数分别为5.1％、7.7％、5.9％和11.3％，批间变异系数分别为12.3％、7.4％、7.4％和6.1％。可用于大规模临床样品的检测分析。 本研究的第二部分，针对PRRSV设计了特异性引物和TaqMan MGB荧光探针，对扩增条件和体系进行优化，成功建立的PRRSV检测方法，敏感度为1×102拷贝/μL，该方法具有较好的特异性、重复性和稳定性，批内的变异系数分别为7.5％、7.5％、11.2％和12.3％，批间四个浓度梯度的变异系数分别为12.2％、10.1％、7.8％和8.4％。用于检测临床样本的CSFV，对已知阳性标本和未感染的阴性标本与传统的普通PCR方法检测血清中CSFV抗原结果进行比较，表明该方法准确性高，可用于临床检测分析。 本研究的第三部分，针对FMDV设计引物，优化荧光PCR反应体系，建立针对口蹄疫各型的TaqMan MGB探针荧光定量PCR检测方法。该方法的检测上下限分别为107拷贝/μL和102拷贝/μL；可以检测包含常见O型、A型、亚洲I型等在内的口蹄疫抗原，避免了漏检现象；确定了TaqMan MGB探针荧光定量RT-PCR检测方法体系；该方法敏感性高，特异性好，避免了使用病毒分离、普通PCR等方法出现耗时长、易散毒、灵敏度不足等问题。 本研究的第四部分，针对PEDV设计引物和荧光探针，进行最佳荧光定量反应总体系和扩增条件研究，建立TaqMan MGB探针荧光定量检测方法，敏感度达到1×102拷贝/μL。四个不同的标准品梯度的批内的变异系数分别为9.1％、9.6％、5.4％和11.3％，批间四个浓度梯度的变异系数分别为11.8％、8.0％、12.8％和9.2％。说明该方法具有较好重复性和稳定性；对已知阳性标本和未感染的阴性标本进行比对实验及产物测序验证，表明该方法符合率高可用于临床检测。 本研究的第五部分，根据CSFV和PRRSV基因序列设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan MGB荧光探针，通过优化反应体系和扩增条件，建立CSFV和PRRSV双重双色荧光定量PCR检测方法。该方法检测下限为1×102拷贝/μL，敏感性高于常规RT-PCR。而且与其他一些猪病毒无交叉反应情况，具有较好的特异性、重复性和稳定性。为CSFV和PRRSV混合感染的检测提供技术支持，在动物疫病诊断中具有应用价值。