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乳酸菌是人和动物肠道内重要的益生菌群，与人类生活密切相关。乳酸菌作为一种可安全使用的食品级微生物，其应用历史长久，且被广泛地用于食品加工、工业发酵以及微生态制剂研制等多种领域，其中绝大多数种类的乳球菌和乳杆菌均可用于安全生产。乳酸菌具有提高人和动物胃肠道粘膜免疫功能的作用，可作为免疫佐剂，也是表达外源蛋白最理想的候选载体菌株。随着对乳酸菌分子生物学研究的日益深入以及其在食品、医药等行业的广泛应用，可利用现代分子生物学技术来构建和应用乳酸菌食品级高效表达载体系统，这对于乳酸菌应用潜能的开发和乳品工业的发展具有十分重要意义，也是近年来的研究热点。乳酸乳球菌能够广泛的存在于人和动物消化道中，并发挥着重要的生理作用，而且其在作为安全性良好的外源基因表达宿主菌方面也已显现出较大的发展潜力。 乳酸菌整合载体主要用于染色体突变，即通过整合或基因替代进行任意特殊位点基因的改变。食品级整合载体是在染色体上进行基因重组，无选择标记、无碱基残留，且重组多发生在非编码区域。温敏型质粒在一定温度范围内可正常复制，当温度高于一定阀值时质粒复制效率降低或不复制。反选择标记基因指在特定的筛选条件下，含有反选择标记基因的菌株死亡，不含有反选择标记基因的可以存活下来，因此既不引入抗性基因又能达到筛选的目的。尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因(uracil phosphoribosyl transferase，UPP)表达产物为尿嘧啶磷酸核糖转移酶，该酶可作用于5-氟尿嘧啶，使其转化生成5-氟单磷酸脱氧尿嘧啶，通过对胸腺嘧啶核苷酸合成酶进行抑制，最终导致细胞死亡。upp基因可利用这一特性作为反选择标记基因。 本研究以pWV01型温敏质粒为主要载体，构建了含有Lactococcus lactis MG1363 upp表达盒（作为反选择标记）的载体pGBWVHC32-upp，经温度敏感性试验测试显示，pGB WVHC32-upp在L.lactis MG1363中的复制shut-off温度为40℃，因此将39℃作为其筛选温度。并以pGBWVHC-32upp作为整合载体骨架，构建了4个用于基因打靶整合系统操作的整合载体，分别为pGBWVHC32upp-1L1R、pGBWVHC32upp-1L2R、pGB WVHC32upp-2L1R和pGB WVHC32upp-2L2R。 根据本研究获得的筛选温度建立了乳酸菌基因打靶整合系统的筛选方法:分别将构建的4个整合载体电转化入L.lactis MG1363中过夜培养;单克隆菌落经培养后按1％比例转接GM17液体培养基39℃培养，并按照筛选方法进行筛选，最后将经1∶1000-10000稀释的菌液涂布于含有5-FU的SDM培养基上32℃培养1-2天;挑取菌落提取基因组经PCR鉴定获取缺失upp基因的乳酸乳球菌ΔuppL.lactis MG1363突变菌株。 研究结果表明，利用基因打靶整合系统经筛选可以获得Δupp L.lactis MG1363突变菌株。提取乳球菌基因组DNA，经PCR鉴定目的基因的靶位点获得了缺失。实验表明，获得的ΔuppL.lactis MG1363突变菌株经多次传代仍可保持遗传稳定性，并且与野生型L.lactisMG1363的生长曲线相似。碳源利用分析试验结果表明，缺失菌株除了有对5-FU的抗性外，其碳源代谢与野生型菌株没有区别。扫描电镜结果分析得出，缺失菌L.lactis MG1363和野生菌株在对数生长期、平台期和衰退期的形态学观察没有差异。 为了检测upp基因的缺失是否会对乳酸乳球菌的代谢通路产生影响，进而会在食品级应用方面存在潜在的危害，本研究对ΔuppL.lactis MG1363和野生菌株的RNA样品进行RNA-Seq测序，通过对这两株菌的RNA进行提取、转录组测序及差异基因表达进行分析(|Log2 Ratio|＞1，p-value＜0.05，FDR＜0.001)，发现:Δupp L.lactis MG1363相对于野生菌株显著上调和下调表达的基因数分别为6个和10个。在ΔuppL.lactis MG1363中，upp基因的转录并未被检测到，这与获得缺失upp基因的菌株表型特征相符。差异基因11mg_0201是唯一一个与代谢相关的蛋白酶基因，提示upp基因缺失并没有造成代谢途径的显著变化，表明upp基因缺失并不会造成菌体代谢毒性，符合食品安全级别。 在缺失upp基因的乳酸乳球菌菌株中转化入含有表达upp基因的质粒时，重组菌无法在含5-FU的培养基上生长，所以可将其作为反选择筛选标记构建基因缺陷互补型质粒载体系统。本研究以L.lactis MG1363 pH诱导分泌型质粒pAMJ399作为表达载体，构建了重组质粒pAMJ399upp-CaIFN-γ，并电转化入ΔuppL.lactis MG1363中，通过反选择标记筛选到重组乳酸乳球菌pAMJ399upp-CaIFN-γ/ΔuppL.lactis MG1363，其可自身产酸启动诱导。Western blot检测结果显示，在菌体中可见与兔抗CaIFN-γ抗体特异性发生反应的约20ku的目的蛋白，证明CaIFN-γ蛋白在重组乳酸乳球菌中获得了表达。 以上结果表明，可以利用该基因打靶整合系统对乳酸乳球菌染色体上非必须位点进行删除;该基因打靶整合系统在L.lactis MG1363中适用，可进行无选择标记的基因删除，以便对基因的功能进行研究，也可以利用upp基因作为反选择标记构建基因缺陷互补型质粒载体系统表达异源蛋白，为研究符合生物安全的基因工程重组乳酸乳球菌奠定基础。