论文部分内容阅读
自噬是细胞维持稳态的一种机制，自上世纪50年代由比利时科学家Christian首次发现后，愈发引起众多学者的关注。自噬是细胞内自噬小体与溶酶体结合降解自身细胞器和其他大分子的过程，它除了可以维持细胞内成分更新外，还可以选择性识别并清除入侵的病原微生物，在细胞与病原体相互作用的过程中发挥着重要的作用。寄生虫是除细菌、病毒之外的一类重要病原体，虫体刺激宿主细胞，在诱导和逃避宿主免疫反应之间保持一种平衡，而宿主细胞也在感染和消除感染之间保持一种平衡。目前，细胞自噬与寄生虫感染相互作用的研究多集中在危害较为严重的胞内寄生虫如顶复门孢子纲的弓形虫、疟原虫和肉足鞭毛纲的锥虫上。对于隐孢子虫与宿主自噬之间的相互作用研究尚属空白。 本研究围绕隐孢子虫入侵宿主细胞这一环节，利用微小隐孢子虫HCT-8细胞培养模型，初步探讨了虫体感染对宿主细胞自噬之间的相互作用关系。首先通过犊牛传代，卵囊收集、纯化、鉴定获得微小隐孢子虫卵囊用于体外感染实验。通过对不同培养基种类、血清浓度摸索，确定1640培养基，10％FBS条件为体外感染实验的最优培养条件。通过HE染色和DAPI染色观察微小隐孢子虫在HCT-8细胞上的发育特性，摸清其发育阶段的各个时间节点，结合参考文献以及我们具体的实验条件，确定感染后3h，8h，18h作为评价其入侵率的时间节点。在优化好的隐孢子虫HCT-8宿主细胞体外培养模型基础上，分别利用透射电镜、免疫荧光、免疫印迹技术探讨了微小隐孢子虫感染对宿主细胞HCT-8自噬的激发作用。研究结果表明，微小隐孢子虫感染后宿主细胞的自噬泡数目增多，HCT-8细胞LC3Ⅱ蛋白表达量增高，HCT-8细胞的自噬水平提高。继而建立并优化了药物对细胞自噬活性的预调控体系，掌握自噬诱导剂Rapamycin,EBSS，抑制剂3-MA的最佳使用浓度或作用时间。分别通过透射电镜，免疫荧光，免疫印迹技术研究对药物诱导细胞自噬活性调控体系的作用进行验证。通过微小隐孢子虫对不同调控处理组细胞的入侵实验，结合虫体入侵评价方法计算微小隐孢子虫对不同处理组细胞的入侵率差异，发现微小隐孢子虫对自噬诱导组细胞的入侵率低于正常对照组细胞;而对自噬抑制组细胞的入侵率高于正常对照组细胞。在一定程度上说明了上调宿主细胞的自噬水平，微小隐孢子虫感染率下降;而下调宿主细胞自噬水平，微小隐孢子虫的感染率反而升高。以上研究结果表明，宿主细胞自噬可能在防御隐孢子虫入侵中发挥重要作用，为进一步探讨其入侵机制和疾病防控提供了科学依据。