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药用野生稻(Oryza officinalis)是中国三种野生稻之一,具有多种优良遗传特性,基因组类型为CC型,与栽培稻AA型差异大,是拓宽水稻育种遗传基础、培育新品种的重要资源。然而由于花粉柱头之间的难以识别及染色体难以配对等生殖障碍原因,我们很难用常规育种方法将药用野生稻遗传物质转移到栽培稻中,而且近些年来由于自然生境的变迁及人为干扰破坏等原因,药用野生稻资源在云南分布点急剧减少处于濒临状态,因此有必要利用现代分子生物学技术加快保护和利用云南药用野生稻资源的步伐。
新一代可转化双元细菌人工染色体(Binary BAC,BIBAC)既保持了BAC载体的所有特征,能在大肠杆菌中繁殖,同时该载体又含有T-DNA的左右臂(LB和RB),能在农杆菌中繁殖并可直接转化到植物中。因此,双元细菌人工染色体基因组文库的构建既可在分子水平上保护珍惜植物种质资源,同时又可用于筛选目的基因,或者通过图位克隆分离功能基因,更为有价值的是可以在不知道基因序列或尚未精确定位之前,通过农杆菌直接转化受体植物建立“渗入系”。
本研究在参考前人BAC、BIBAC和TAC文库构建方法的基础上,采用聚乙二醇法及连续两次的氯化铯连续梯度离心优化了纯化粗提质粒的纯化技术;改进了脉冲电泳条件及药用野生稻基因组酶切条件从而优化建立了野生稻大片段DNA的回收纯化技术;采取10℃,18℃,20℃,4℃温度循环方法优化建立了药用野生稻核基因组大片段与BIBAC载体的连接技术;通过对连接液在0.025μm的Millipore(VSWP02500)滤膜上脱盐及浓缩处理建立了高效的转化技术。在这一系列技术优化的基础上建立了一套完整的BIBAC基因组文库构建技术体系,并利用该技术构建了首个云南药用野生稻核基因组BIBAC文库,该文库保存在140个384孔板中,包含了共计53760个克隆,随机检测其中的50个阳性克隆,DNA插入片段大小分布在25~200kb之间,平均为76 kb。按照药用野生稻基因组为697Mb计算,该文库覆盖了药用野生稻基因组大小的5.86倍以上。该BIBAC文库的构建,将在分子水平对云南药用野生稻资源加以保护,并对以后进一步克隆利用云南药用野生稻的有利基因、构建药用野生稻重要优良基因在栽培稻中的“渗入系”、加快水稻分子育种步伐具有重要意义。