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研究背景：
冠状动脉痉挛(coronary artery spasm,CAS)和冠脉粥样硬化是急性冠脉综合症(acute coronary syndrome,ACS)、变异型心绞痛、冠状动脉微血管病性心绞痛等多种心血管疾病的重要病因,严重威胁人类生命健康。CAS发病率高,2008年公布的CASPAR试验结果表明,超过1/4的ACS患者没有明显的冠脉血管堵塞,其中约50％的患者存在明确的冠脉痉。MICHEL E.为1089名心绞痛患者做冠脉痉挛激发试验,20％的新近心梗患者激发试验阳性；静息心绞痛患者阳性率为38％,而在变异性心绞痛患者中,这一数据为85.1％。与冠脉粥样硬化比较,CAS基础研究滞后、临床关注不够。目前CAS的发病机制尚未明了。传统学说认为CAS的主要病理发病机制是平滑肌细胞外钙离子内流增多和内皮源性舒张因子缺乏。临床实践中,全身及冠脉内使用钙离子受体阻滞剂(calcium channel blocker,CCB)和NO供体都能一过性缓解冠脉痉挛,然而其远期疗效不确切。GAS是心血管病病房最棘手的问题之一。阐明冠脉痉挛发病机制,寻找新的药物作用靶点是当务之急。血管平滑肌细胞膜电位与平滑肌血管舒缩反应性密切相关。血管平滑肌细胞膜超级化,促使细胞膜上电压依赖性钙通道(voltage depented calcium channel,VDCC)关闭,外钙内流减少,导致平滑肌舒张,即所谓的超极化舒张机制。超极化舒张机制是内皮源性舒张受损的一种重要补偿机制。血管平滑肌细胞上多种钾通道开放可使细胞膜超极化。大电导钙敏感钾通道(Ca2+-activated K+channel,BKca)是血管平滑肌的优势钾通道,是形成膜电位的重要因为。BKca通道敏感于血管平滑肌细胞内游离Ca2+、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)、三磷酸腺苷(ATP)、蛋白激酶和细胞膜电位等与细胞功能密切相关的重要信号。白介素1β(Interleukin-1,IL-1β)与冠心病、心力衰竭、血管痉挛等多种心血管疾病密切相关,上述疾病常伴随血管平滑肌细胞膜电位变化。但IL-1β是否通过BKca通道影响膜电位,进而影响血管平滑肌细胞生物学性状目前未见报道。本课题应用IL-1β与大鼠主动脉平滑肌细胞共培养,运用蛋白印记技术和膜片钳技术,分析不同时间点BKca通道蛋白表达与通道电流(IBK)动态变化；运用共聚焦显微镜观察IL-1β通过平滑肌细胞内H2O2对膜电位及IBK影响,旨在阐明BKca通道参与冠脉痉挛的机制,开创防治冠脉痉挛药物作用新靶点,具有重要的理论和临床意义。
研究方法
本课题用不同浓度IL-1β与大鼠主动脉平滑肌细胞(aortal smooth musclecells,ASMC)共培养,观察IL-1β对BKca通道的影响及其时间动态变化。运用激光共聚焦显微镜观察IL-1β对大鼠ASMC膜电位影响的时间动态变化,分析活性氧簇清除剂catalase、BKca通道阻断剂IBTX、BKca通道开放剂NS1619对膜电位的影响,并探讨其中的关联。为了明确IL-1β通过H2O2对BKca通道活性影响,我们运用膜片钳技术检测有或无catalase存在时高浓度IL-1β对单通道开放几率Po的作用。全细胞模式下,观察不同时间点IL-1β对ASMC培养液全细胞钾电流IK的影响及IBTX降低IK幅度变化。此外,IL-1β处理细胞后我们检测细胞内H2O2动态变化,检测H2O2对平滑肌细胞BKca通道NPo的影响,并运用WB检测BKca通道α亚基表达量的动态变化。
研究结果
1、IL-1β与ASMCs短时间共培养:①IL-1β处理细胞30min后,细胞膜电位较对照组呈剂量依赖性减小；catalase(H2O2清除剂,200U/ml)及IBTX(BKca通道阻断剂,100nM)存在时,与对照组相比,IL-1β处理细胞30min膜电位减小无统计意义；⑦全细胞膜片钳技术(whole-cell mode)检测发现,与control(生理盐水)比较,IL-1β30min处理组全细胞钾电流IK上调；与control+IBTX比较,IL-1β30min+IBTX无统计学差异:③H2O2检测试剂盒检测50 ng/ml IL-1β处理细胞30min后H2O2水平,与co ntrol比较,H2O2增加有统计学意义(69.1±7.1 VS 32.0±3.2,P(0.01)；④单通道膜片钳技术(Inside-out mode)检测发现,IL-1β30min处理组BK单通道NPo增加；IL-1β30min+catalase处理细胞NPo减小,与control比较,NPo无统计学差异；
2、IL-1β与ASMCs长时间共培养:①IL-1β处理细胞48h后MTT检测ASMCs活性显示,与对照组比较,ASMCs活性下降无统计意义；②IL-1β处理细胞48h后,细胞膜电位较对照组呈剂量依赖性增加；catalase及IBTX存在时,与IL-1β48h组相比,膜电位减小有统计意义；③H2O2检测试剂盒检测50 ng/ml IL-1β处理细胞48h后H2O2水平,与control比较,H20z增加有统计学意义(118.1±11.9 VS 32.0±3.2,P(0.01)；④5 nM 4-AP(Kv通道阻断剂)存在时,ASMCs膜电位去极化。但50 ng/ml IL-1β48h处理细胞,与对照组(saline)比较,4-AP以及4-AP+IBTX膜电位变化无统计意义；⑤全细胞膜片钳技术(whole-cellmode)检测发现,与control(生理盐水)比较,IL-1β48h处理组全细胞钾电流IK下调；与control+IBTX比较,IL-1β48h+IBTX无统计学差异；⑥单通道膜片钳技术(Inside-out mode)检测发现,IL-1β48h处理组BK单通道NPo减小；IL-1β48h+catalase处理细胞,与IL-1β48h组比较,NPo增加有统计学差异,但与control比较,NPo仍减小有统计差异:⑦蛋白印迹(western)检测IL-1β48h处理组对BK通道α亚基表达量的影响发现,与control比较,α亚基表达量呈IL-1β剂量依赖性减少。与IL-1β48h处理组比较,IL-1β48h+catalase组α亚基表达量增加有统计意义。
结论
(1)IL-1β通过H2O2影响大鼠血管平滑肌细胞膜电位,其变化呈双相特征,即IL-1β短时间处理细胞,膜电位下调,长时间处理细胞则反之；
(2)IL-1β通过H2O2调节血管平滑肌细胞BK通道活性,其调节具有双相特征；即IL-1β短时间处理细胞上调BK活性,长时间处理细胞则反之；
(3)IL-1β长时间处理细胞下调BK通道结构亚基-α亚基表达量,这可能是IL-1β长时间处理细胞影响BKca通道功能的又一机制；
(4)急性炎症通过上调血管平滑肌细胞BK活性,导致膜电位下调,发挥生物学效应；慢性炎症通过下调BK活性及BK蛋白表达,导致膜电位上调。H2O2在此过程中起到中介作用。
(5)BKca通道是形成血管平滑肌细胞膜电位重要因为；膜电位与心血管疾病密切相关,BKca通道可能是心血管疾病新的药物靶点。