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目的：
卵巢癌是女性生殖系统中恶性程度最高的肿瘤，研究表明：卵巢癌肿瘤细胞减灭术后的化疗治疗无可替代，以铂类为基础的化疗方案被视为标准方案，作为一线化疗方案广泛应用于临床。近年来，尽管新的化疗药物层出不穷，但晚期卵巢癌患者 5 年生存率仍得到有效提高，其主要原因是化疗耐药。本研究从卵巢癌化疗耐药这一临床实际出发，在本课题小组前期工作（在细胞水平证实氯化镧在体外可增强卵巢癌顺铂耐药细胞化疗敏感性）的基础上，在动物水平验证体外试验的研究结果，利用差异蛋白质组学寻找出差异表达的蛋白，并利用免疫组化以及western-blot技术验证其结果，初步探讨氯化镧增强卵巢癌顺铂耐药细胞敏感性的分子机制，为顺铂耐药性卵巢癌的临床治疗提供新的思路和手段，同时为开发稀土氯化镧的药用价值提供科学依据。
方法：
1.两株细胞（敏感株和耐药株）体内移植瘤分别设为对照组、顺铂组、氯化镧组、氯化镧+顺铂组，游标卡尺测量记录各实验组体内瘤结节的长度（a）、宽度（b）和高度（c），按公式计算肿瘤近似体积（V），V=abc*π/6，单位cm3。
2.用 TUNEL 检测不同组（对照组、顺铂组、氯化镧组、氯化镧+顺铂组） COC1和COC1/DDP细胞移植瘤的凋亡情况。
3.免疫组化法检测不同组（对照组、顺铂组、氯化镧组、氯化镧+顺铂组） COC1和COC1/DDP细胞移植瘤肿瘤相关蛋白表达情况。
4.采用非标定量蛋白质组学分析方法测定顺铂应用前后对顺铂敏感的卵巢癌细胞COC1和对顺铂耐药的卵巢癌细胞COC1/DDP中的差异表达蛋白。利用GO分析，根据这些蛋白质的细胞成分、生物学过程和分子功能，将它们分为不同的亚群。利用KEGG通路分析来确定这些蛋白质参与的关键信号通路。
5.取对数生长期的 COC1/DDP 细胞分为对照组、顺铂组、氯化镧组、氯化镧+顺铂组，培养48h后用Western blot法检测不同实验组细胞中ERCC1、Ki67、CDK6、c-Cbl和EB1 5种蛋白的表达情况。
结果：
1：氯化镧对体内移植瘤生长的影响：顺铂和氯化镧联合作用可以抑制肿瘤在体内的生长。与对照组比，单用顺铂处理可显著降低肿瘤的重量和体积，分别降低45%和54%（p＜0.001）。顺铂和氯化镧联合处理使肿瘤的重量和体积分别比对照组（p＜0.001）减少54%和61%。相比之下，氯化镧本身对肿瘤的生长的影响无统计学意义（p＞0.005）。在COC1和COC1/DDP两组中得出结果基本一致，结果表明，氯化镧联合顺铂可抑制卵巢肿瘤的体内生长。
2：TUNEL法检测各组移植瘤的凋亡：与对照组相比，顺铂处理后的COC1细胞中的Tunel阳性细胞明显增多，统计学有显著差异（p＜0.001）。与氯化镧+顺铂组相比，氯化镧的加入进一步促进了肿瘤细胞的凋亡，因此顺铂联合氯化镧处理组的凋亡细胞比例显著提高（p＜0.001）。然而，单独使用氯化镧处理组肿瘤细胞与对照组相比，凋亡没有明显的影响（P＞0.05）。在COC1/DDP细胞移植瘤中的结果与COC1细胞移植瘤结果一致。
3：免疫组化法检测各组体内移植瘤中肿瘤相关蛋白表达情况：与对照组相比，顺铂组Ki 67的表达水平降低，氯化镧联合顺铂组Ki67的表达进一步降低，相比之下，单用氯化镧对Ki67表达的影响很小。癌基因和抗凋亡蛋白BCL-2的表达，与Ki67有相似的趋势。相反，人类肿瘤抑制基因BRCA1和BRCA2的表达水平与Ki67和BCL-2相反。也就是说，顺铂提高了BRCA1和BRCA2的表达水平，而顺铂与氯化镧共处理进一步提高了BRCA1和BRCA2的表达水平。DNA修复基因ERCC1的表达，其表达水平与Ki67和BCL-2基本一致，在单用顺铂和顺铂联合氯化镧组中，ERCC1表达的减少。经统计学处理，对照组BCL-2和Ki-67阳性率极显著高于氯化镧组+顺铂组和顺铂组（P＜0.01)。而BRCA1和BRCA2各组的阳性表达率与ERCC1、BCL-2和Ki-67恰好相反。
4：蛋白组学研究结果显示：实验共计检测定性定量蛋白3537个，并对这些蛋白进行了GO注释分析。在COC1和COC1/DDP之间差异表达的蛋白有710个， COC1+顺铂和COC1/DDP+顺铂之间差异表达的蛋白有783个，COC1+氯化镧和COC1/DDP+氯化镧之间差异表达的蛋白有917个， COC1/DDP+顺铂与COC1/DDP+顺铂+氯化镧之间差异表达的蛋白有775个，加顺铂前后，COC1细胞株和COC1/DDP细胞株都有差异的蛋白有411个；加顺铂前后，COC1/DDP和COC1/DDP+氯化镧都有差异的蛋白有536个。其中，14%定位于细胞膜上，KEGG分析，将差异表达的蛋白分为21亚组。
5：采用Western blot技术验证功能蛋白表达结果显示：采用Western blot验证5种功能蛋白（ERCC1、Ki67、CDK6、c-Cbl 和EB1）在顺铂单药、氯化镧单药和顺铂联合氯化镧作用于COC1/DDP 中的表达情况，结果表明：顺铂联合氯化镧组EB1和c-Cbl表达量显著高于对照组和氯化镧组，而ERCC1、Ki67、CDK6在耐药株的表达量与EB1和c-Cbl表达量相反。提示氯化镧可能通过多种途径下调ERCC1、Ki67和CDK6的表达，上调EB1和c-Cbl 的表达增强顺铂的抑瘤作用。
结论：
氯化镧通过多种途径下调 BCL-2、Ki-67、ERCC1 和 CDK6 的表达，上调BRCA1、BRCA2、EB1和c-Cbl 的表达，增强卵巢癌顺铂的敏感性；氯化镧与顺铂联合作用在体内大大促进COC1，COC1/DDP细胞体内移植瘤细胞的凋亡，从而增强顺铂的抑瘤作用，抑制体内肿瘤的生长，但其具体调控机制还需更多的研究。
卵巢癌是女性生殖系统中恶性程度最高的肿瘤，研究表明：卵巢癌肿瘤细胞减灭术后的化疗治疗无可替代，以铂类为基础的化疗方案被视为标准方案，作为一线化疗方案广泛应用于临床。近年来，尽管新的化疗药物层出不穷，但晚期卵巢癌患者 5 年生存率仍得到有效提高，其主要原因是化疗耐药。本研究从卵巢癌化疗耐药这一临床实际出发，在本课题小组前期工作（在细胞水平证实氯化镧在体外可增强卵巢癌顺铂耐药细胞化疗敏感性）的基础上，在动物水平验证体外试验的研究结果，利用差异蛋白质组学寻找出差异表达的蛋白，并利用免疫组化以及western-blot技术验证其结果，初步探讨氯化镧增强卵巢癌顺铂耐药细胞敏感性的分子机制，为顺铂耐药性卵巢癌的临床治疗提供新的思路和手段，同时为开发稀土氯化镧的药用价值提供科学依据。
方法：
1.两株细胞（敏感株和耐药株）体内移植瘤分别设为对照组、顺铂组、氯化镧组、氯化镧+顺铂组，游标卡尺测量记录各实验组体内瘤结节的长度（a）、宽度（b）和高度（c），按公式计算肿瘤近似体积（V），V=abc*π/6，单位cm3。
2.用 TUNEL 检测不同组（对照组、顺铂组、氯化镧组、氯化镧+顺铂组） COC1和COC1/DDP细胞移植瘤的凋亡情况。
3.免疫组化法检测不同组（对照组、顺铂组、氯化镧组、氯化镧+顺铂组） COC1和COC1/DDP细胞移植瘤肿瘤相关蛋白表达情况。
4.采用非标定量蛋白质组学分析方法测定顺铂应用前后对顺铂敏感的卵巢癌细胞COC1和对顺铂耐药的卵巢癌细胞COC1/DDP中的差异表达蛋白。利用GO分析，根据这些蛋白质的细胞成分、生物学过程和分子功能，将它们分为不同的亚群。利用KEGG通路分析来确定这些蛋白质参与的关键信号通路。
5.取对数生长期的 COC1/DDP 细胞分为对照组、顺铂组、氯化镧组、氯化镧+顺铂组，培养48h后用Western blot法检测不同实验组细胞中ERCC1、Ki67、CDK6、c-Cbl和EB1 5种蛋白的表达情况。
结果：
1：氯化镧对体内移植瘤生长的影响：顺铂和氯化镧联合作用可以抑制肿瘤在体内的生长。与对照组比，单用顺铂处理可显著降低肿瘤的重量和体积，分别降低45%和54%（p＜0.001）。顺铂和氯化镧联合处理使肿瘤的重量和体积分别比对照组（p＜0.001）减少54%和61%。相比之下，氯化镧本身对肿瘤的生长的影响无统计学意义（p＞0.005）。在COC1和COC1/DDP两组中得出结果基本一致，结果表明，氯化镧联合顺铂可抑制卵巢肿瘤的体内生长。
2：TUNEL法检测各组移植瘤的凋亡：与对照组相比，顺铂处理后的COC1细胞中的Tunel阳性细胞明显增多，统计学有显著差异（p＜0.001）。与氯化镧+顺铂组相比，氯化镧的加入进一步促进了肿瘤细胞的凋亡，因此顺铂联合氯化镧处理组的凋亡细胞比例显著提高（p＜0.001）。然而，单独使用氯化镧处理组肿瘤细胞与对照组相比，凋亡没有明显的影响（P＞0.05）。在COC1/DDP细胞移植瘤中的结果与COC1细胞移植瘤结果一致。
3：免疫组化法检测各组体内移植瘤中肿瘤相关蛋白表达情况：与对照组相比，顺铂组Ki 67的表达水平降低，氯化镧联合顺铂组Ki67的表达进一步降低，相比之下，单用氯化镧对Ki67表达的影响很小。癌基因和抗凋亡蛋白BCL-2的表达，与Ki67有相似的趋势。相反，人类肿瘤抑制基因BRCA1和BRCA2的表达水平与Ki67和BCL-2相反。也就是说，顺铂提高了BRCA1和BRCA2的表达水平，而顺铂与氯化镧共处理进一步提高了BRCA1和BRCA2的表达水平。DNA修复基因ERCC1的表达，其表达水平与Ki67和BCL-2基本一致，在单用顺铂和顺铂联合氯化镧组中，ERCC1表达的减少。经统计学处理，对照组BCL-2和Ki-67阳性率极显著高于氯化镧组+顺铂组和顺铂组（P＜0.01)。而BRCA1和BRCA2各组的阳性表达率与ERCC1、BCL-2和Ki-67恰好相反。
4：蛋白组学研究结果显示：实验共计检测定性定量蛋白3537个，并对这些蛋白进行了GO注释分析。在COC1和COC1/DDP之间差异表达的蛋白有710个， COC1+顺铂和COC1/DDP+顺铂之间差异表达的蛋白有783个，COC1+氯化镧和COC1/DDP+氯化镧之间差异表达的蛋白有917个， COC1/DDP+顺铂与COC1/DDP+顺铂+氯化镧之间差异表达的蛋白有775个，加顺铂前后，COC1细胞株和COC1/DDP细胞株都有差异的蛋白有411个；加顺铂前后，COC1/DDP和COC1/DDP+氯化镧都有差异的蛋白有536个。其中，14%定位于细胞膜上，KEGG分析，将差异表达的蛋白分为21亚组。
5：采用Western blot技术验证功能蛋白表达结果显示：采用Western blot验证5种功能蛋白（ERCC1、Ki67、CDK6、c-Cbl 和EB1）在顺铂单药、氯化镧单药和顺铂联合氯化镧作用于COC1/DDP 中的表达情况，结果表明：顺铂联合氯化镧组EB1和c-Cbl表达量显著高于对照组和氯化镧组，而ERCC1、Ki67、CDK6在耐药株的表达量与EB1和c-Cbl表达量相反。提示氯化镧可能通过多种途径下调ERCC1、Ki67和CDK6的表达，上调EB1和c-Cbl 的表达增强顺铂的抑瘤作用。
结论：
氯化镧通过多种途径下调 BCL-2、Ki-67、ERCC1 和 CDK6 的表达，上调BRCA1、BRCA2、EB1和c-Cbl 的表达，增强卵巢癌顺铂的敏感性；氯化镧与顺铂联合作用在体内大大促进COC1，COC1/DDP细胞体内移植瘤细胞的凋亡，从而增强顺铂的抑瘤作用，抑制体内肿瘤的生长，但其具体调控机制还需更多的研究。