无籽刺梨RksAGL基因克隆与功能分析

• 作 者: 刘松
• 机 构: 贵州大学
• 出 处: 贵州大学
• 发表日期: 2015年期
• 关键词: 无籽刺梨 基因克隆 遗传转化 生物信息学

本研究以无籽刺梨（Rosa kweichonensisvar.sterilis）花芽为材料，采用同源克隆结合cDNA末端快速扩增技术（Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE）从无籽刺梨中克隆得到AGL基因的cDNA全长，命名为RksAGL。对该基因进行生物信息学和时空表达分析。构建RksAGL基因植物表达载体pSH-35S-RksAGL，通过根癌农杆菌介导遗传转化烟草。获得研究结果如下：　　1、通过RACE技术克隆RksAGL基因的cDNA，全长1089 bp，开放阅读框长度为747 bp，编码248个氨基酸的蛋白。　　2、RksAGL蛋白分子量约为28.56 kDa，理论等电点为9.40，是亲水性蛋白，无信号肽序列，RksAGL基因编码蛋白质二级结构以α-螺旋为主，占56.05％；其次为无规则卷曲占29.44%；延伸链占10.89%；β-转角占3.63%。分析RksAGL基因序列发现其编码的蛋白含有MADS box结构域和K box域，还有C类基因特有的AG motifⅠ和AG motifⅡ，属于MADS-box蛋白的TypeⅡ类型。Blast比对结果显示无籽刺梨RksAGL基因编码的氨基酸序列与玫瑰 AGL基因编码的氨基酸序列（AAD00025.1、BAA90744.1、BAA90746.1和BAA90745.1）一致性在99%以上，与草莓AGL基因编码的氨基酸序列（AAD45814.1）一致性为91%，与烟草AGL基因编码的氨基酸序列（AAA17033.1）一致性为68%。通过分析可认为RksAGL基因是无籽刺梨的AGAMOUS（AG）基因，归属于C类基因euAG进化系的成员。　　3、实时定量PCR分析表明RksAGL基因仅在雄蕊和心皮中表达，在萼片和花瓣中未检测到该基因的表达信号，而且，RksAGL基因在心皮的表达量是雄蕊表达量的1.6倍。　　4、在初始载体pSH737的基础上，构建了RksAGL基因的双子叶植物表达载体pSH-35S-RksAGL，并使用农杆菌介导法遗传转化烟草（Nicotiana tabacumcv.Xanthin），对获得的抗性植株进行GUS组织化学染色和基因组PCR检测，证明了RksAGL基因已整合进入转基因烟草的基因组中，获得了含RksAGL基因的转基因烟草7株。移栽生长后的转基因烟草在表型上与野生型烟草无明显差异，开花后转基因烟草和野生型烟草的雄蕊、雌蕊没有观察到明显差异，而转基因烟草花色比野生型淡一点。