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并殖吸虫俗称肺吸虫,某些寄生于人体的虫体可引起并殖吸虫病(肺吸虫病)。并殖吸虫在分类上隶属于生物的真核总界、动物界、扁形动物门、吸虫纲、复殖目、并殖科。并殖吸虫种类命名甚多,存在同种异名和种名错定等诸多问题。并殖吸虫在东亚、东南亚、非洲和拉丁美州等国家广泛存在；中国各地也均有发现,主要在江南、西南与东北各地。从1879年Ringer首先在我国台湾发现人体病例130年以来,世界学者对并殖吸虫的特征、独立地位、地理分布和致病作用等存在分歧。主要以并殖吸虫成虫形态和生活史为依据的传统分类存在一定的局限性,如因不同地区、不同宿主、不同发育期和标本制作时个体差异所导致成虫的形态差异。而对于生活史,目前只有少数虫种的生活史被完整阐明,有一些虫种的第一和第二中间宿主尚未被证实。20世纪60-80年代,由于并殖吸虫分类研究极度活跃,出现了很多并殖吸虫新种的描述。20世纪90年代以来,分子生物学的发展为研究物种遗传变异奠定了基础。本课题基于物种DNA分析的分子生物技术较先进,具有仅需少量的材料即可进行研究、操作简单、快速、特异和敏感等特点。又基于本课题组先前研究结果显示并殖吸虫可能存在种间差异,而ITS2序列具有种株特异性。因此,本实验采用ITS2基因序列分析技术对鄂浙赣3省10地12株并殖吸虫进行遗传变异检测,以了解基因序列变化差异,为并殖吸虫分类提供依据,同时也为湖北省并殖吸虫流行区的划分提供可靠的分子生物学依据。材料与方法采集鄂赣浙3省10地：湖北省咸宁市温泉区桂花镇茅田、江西武宁县三爪、浙江绍兴兰亭乡、湖北省赤壁市赵李桥镇柘砰村、湖北省十堰市花果、湖北省五峰县、湖北鹤峰县五里镇南村、湖北鹤峰县走马镇大典、湖北随州和湖北神农架林区等10地共12株并殖吸虫。其中湖北咸宁株、湖北十堰株、江西武宁株和浙江兰亭株为成虫,湖北随州株为童虫,其余5地标本均为囊蚴。为避免混淆,本文中均以地理株命名。对12株并殖吸虫标本进行形态学观察测量,并提取4地成虫、1地童虫和5地囊蚴的基因组DNA。用3s’和BD2两对引物扩增ITS2序列,获得基因片段交由上海生工公司进行基因测序。所得12株并殖吸虫ITS2序列经Bioedit、Clustalx和MEGA4.0等软件进行遗传距离分析,并构建遗传进化树。结果1.外形观察：成虫湖北十堰株呈长梭形,湖北咸宁株、江西武宁株和浙江兰亭株等3株呈椭圆形；囊蚴5地囊蚴呈椭圆形或类圆形,囊壁2层,排泄囊内含黑色颗粒,经鉴定为并殖吸虫囊蚴。其中湖北赤壁株内壁较厚；五峰a、五峰b、走马a、走马b和五里等5株内壁较薄；湖北神农架株的囊蚴形态因故已有变形,但可以确定为并殖吸虫；童虫湖北随州株呈长梭形。2.DNA提取：DNA溶液A260/280值经测定在1.60～2.00之间,纯度符合要求。3.PCR扩增及基因测序,通过MEGA4.0分析基因序列。①各株间差异湖北咸宁株、江西武宁株、浙江兰亭株和湖北赤壁株等4株的遗传距离在0.01897～0.11278；湖北走马a、b两株,湖北五峰a、b两株,湖北十堰株,湖北五里株和湖北随州株等7株斯氏并殖吸虫在遗传树上呈现两支,最后成一大支,其7株遗传距离是0.00004-0.08401；湖北神农架发现的并殖吸虫,该株在进化树上独立成一支,与卫氏并殖吸虫遗传距离在0.01897-0.11278,与斯氏并殖吸虫遗传距离在0.01355-0.12195。②系统进化树通过MEGA4.0软件所构建的进化树中12株并殖吸虫分为三类：江西武宁株、浙江兰亭株、湖北咸宁株和湖北赤壁株等4株为卫氏并殖吸虫；湖北走马a、b两株,湖北五峰a、b两株,湖北十堰,湖北五里和湖北随州等7株为斯氏并殖吸虫；湖北神农架株独立成一类,为尚不明确的一种并殖吸虫。4.湖北省存在两个并殖吸虫流行区：以卫氏并殖吸虫为主的鄂东南和以斯氏并殖吸虫为主的鄂西两个并殖吸虫病流行区。结论1.根据基因测序分析的结果,3省10地12株并殖吸虫在基因水平上分为3类：江西武宁株、浙江兰亭株、湖北咸宁株和湖北赤壁株等4株为卫氏并殖吸虫；湖北走马a、b两株,湖北五峰a、b两株,湖北十堰,湖北五里和湖北随州等7株为斯氏并殖吸虫；湖北神农架株独立成一类,为尚不明确的一种并殖吸虫。2.湖北省存在以卫氏并殖吸虫为主的鄂东南和以斯氏为主的鄂西两个并殖吸虫病流行区。3.采用童虫、成虫和囊蚴等3个不同虫期标本,尤其是本实验首次采用童虫样本,对研究并殖吸虫遗传变异不存在影响。