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目的本研究以山西道地药材黄芪为研究对象，通过研究膜分离技术得到的小分子有效成分部位(M4，以皂苷类、黄酮类成分为主)的调节免疫作用机制，以期为黄芪药材膜分离技术应用于小分子部位的开发利用提供新思路。
方法采用聚醚砜膜(10 kDa)分离纯化黄芪小分子部位，以黄芪总皂苷透过率为评价指标，对药液温度、料液比、pH值、操作时间进行单因素试验，通过三因素三水平正交试验对黄芪多级膜分离工艺优化获得以黄芪皂苷类、黄酮类成分为主的M4部位。采用药理学方法，利用环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)、氢化可的松(Hydrocortisone，HC)制备免疫抑制大鼠模型，评价M4部位免疫调节活性。通过液质联用(Ultra-Performance Liquid Chromatograph-Mass Spectrometry, UPLC-MS)技术对M4部位化学成分进行鉴定，结合网络药理学相关方法通过TCMSP、PubChem、SWISS等公共数据库筛选活性成分和疾病靶点，构建成分-靶点和疾病-靶点的PPI网络，进行KEGG富集分析信号通路，研究M4部位免疫调节的信号通路并探讨其作用机制。采用血清代谢组学的方法利用核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)技术分析血清代谢物质，采用主成分分析(Principal Components Analysis，PCA)、单变量统计分析(Univariate Statistical Analysis，UVA)、正交偏最小二乘法-判别分析(Orthogonal Partial Least Squares Discrimination Analysis，OPLS-DA)对化合物进行筛选，探讨其免疫调节的代谢通路，阐明M4部位免疫调节作用机制。
结果黄芪膜分离的最佳分离工艺与步骤为：每步骤上样量均为2L，①使用聚醚砜膜(30 kDa)对黄芪药液进行预处理；②使用聚醚砜膜(10 kDa)在料液比为1:25，药液pH值为4.85，操作时间为9min，操作压力为8.5MPa条件下进行分离；③聚酰胺膜(2.5 kDa)在操作压力8.5MPa，操作时间为8min条件下继续进行分离；④使用聚酰胺膜(600 Da)进行浓缩处理。在最优条件下得到的M4部位冻干粉总皂苷纯度可达206.76mg/g，比黄芪药液冻干粉提高2.67倍。实验药理学表明，在CTX模型中，M4部位可极显著提高大鼠脾脏指数(P＜0.01)，显著提高大鼠血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平(P＜0.05)，显著提高脾淋巴细胞中活化CD4+/CD8+的比值(P＜0.05)；在HC模型中，M4部位可显著提高大鼠血清中IL-2、IFN-γ水平(P＜0.05)，极显著提高脾淋巴细胞中活化CD4+/CD8+的比值(P＜0.01)。M4部位对脾脏有一定的保护作用，并可通过调节血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平，调节两种模型大鼠的免疫能力。液质分析表明，M4部位共检测到24种成分，主要有14种黄酮类化合物(芦丁、毛蕊异黄酮苷、华良姜素等)、8种皂苷类成分(黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、乙酰黄芪皂苷Ⅰ等)。24种成分(47个一级靶点)与37个免疫相关一级靶点映射，共得到核心靶点73个。经过KEGG富集分析，共得到16条可信度极高(P-Value＜0.01)的信号通路。M4部位可能是通过PI3K-AKT、NF-κB、Jak-STAT等信号通路与FcepsilonRI信号通路、B细胞受体信号通路、T细胞受体信号通路、趋化因子信号通路等免疫相关信号通路共同作用，调节机体免疫力。经过OPLS-DA分析，采用VIP＞1及P＜0.01筛选差异代谢物。M4是通过调节乳酸、肌酸、甘油、赖氨酸、甘氨酸、葡萄糖、酮异己酸等物质的水平产生的免疫活性，主要干预机体氨基酸代谢(甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，谷胱甘肽代谢，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成)和能量代谢(甘油脂代谢，乙醛酸及二羧酸代谢，丙酮酸代谢，淀粉和蔗糖代谢，半乳糖代谢)。在CTX模型上以氨基酸代谢为主，在HC模型上以能量代谢为主。
结论利用优选出的黄芪膜分离工艺分离纯化得到的M4部位对CTX、HC两种药物造成的免疫抑制模型均有一定的免疫调节作用。UPLC-MS技术分析得到的M4部位化学成分用于网络药理学的分析，使得网络药理学结果可信度更高。血清代谢组学分析得到的代谢通路，更完善地阐释了M4部位免疫调节作用机制。研究从药理学、网络药理学、血清代谢组学多角度，以CTX、HC两种模型，对黄芪药材膜分离得到的小分子部位(M4部位)的免疫调节作用与机制进行研究，有利于黄芪中以皂苷类、黄酮类成分为主的小分子部位的进一步开发利用，为膜分离技术应用与开发利用提供了基础。
方法采用聚醚砜膜(10 kDa)分离纯化黄芪小分子部位，以黄芪总皂苷透过率为评价指标，对药液温度、料液比、pH值、操作时间进行单因素试验，通过三因素三水平正交试验对黄芪多级膜分离工艺优化获得以黄芪皂苷类、黄酮类成分为主的M4部位。采用药理学方法，利用环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)、氢化可的松(Hydrocortisone，HC)制备免疫抑制大鼠模型，评价M4部位免疫调节活性。通过液质联用(Ultra-Performance Liquid Chromatograph-Mass Spectrometry, UPLC-MS)技术对M4部位化学成分进行鉴定，结合网络药理学相关方法通过TCMSP、PubChem、SWISS等公共数据库筛选活性成分和疾病靶点，构建成分-靶点和疾病-靶点的PPI网络，进行KEGG富集分析信号通路，研究M4部位免疫调节的信号通路并探讨其作用机制。采用血清代谢组学的方法利用核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)技术分析血清代谢物质，采用主成分分析(Principal Components Analysis，PCA)、单变量统计分析(Univariate Statistical Analysis，UVA)、正交偏最小二乘法-判别分析(Orthogonal Partial Least Squares Discrimination Analysis，OPLS-DA)对化合物进行筛选，探讨其免疫调节的代谢通路，阐明M4部位免疫调节作用机制。
结果黄芪膜分离的最佳分离工艺与步骤为：每步骤上样量均为2L，①使用聚醚砜膜(30 kDa)对黄芪药液进行预处理；②使用聚醚砜膜(10 kDa)在料液比为1:25，药液pH值为4.85，操作时间为9min，操作压力为8.5MPa条件下进行分离；③聚酰胺膜(2.5 kDa)在操作压力8.5MPa，操作时间为8min条件下继续进行分离；④使用聚酰胺膜(600 Da)进行浓缩处理。在最优条件下得到的M4部位冻干粉总皂苷纯度可达206.76mg/g，比黄芪药液冻干粉提高2.67倍。实验药理学表明，在CTX模型中，M4部位可极显著提高大鼠脾脏指数(P＜0.01)，显著提高大鼠血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平(P＜0.05)，显著提高脾淋巴细胞中活化CD4+/CD8+的比值(P＜0.05)；在HC模型中，M4部位可显著提高大鼠血清中IL-2、IFN-γ水平(P＜0.05)，极显著提高脾淋巴细胞中活化CD4+/CD8+的比值(P＜0.01)。M4部位对脾脏有一定的保护作用，并可通过调节血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平，调节两种模型大鼠的免疫能力。液质分析表明，M4部位共检测到24种成分，主要有14种黄酮类化合物(芦丁、毛蕊异黄酮苷、华良姜素等)、8种皂苷类成分(黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、乙酰黄芪皂苷Ⅰ等)。24种成分(47个一级靶点)与37个免疫相关一级靶点映射，共得到核心靶点73个。经过KEGG富集分析，共得到16条可信度极高(P-Value＜0.01)的信号通路。M4部位可能是通过PI3K-AKT、NF-κB、Jak-STAT等信号通路与FcepsilonRI信号通路、B细胞受体信号通路、T细胞受体信号通路、趋化因子信号通路等免疫相关信号通路共同作用，调节机体免疫力。经过OPLS-DA分析，采用VIP＞1及P＜0.01筛选差异代谢物。M4是通过调节乳酸、肌酸、甘油、赖氨酸、甘氨酸、葡萄糖、酮异己酸等物质的水平产生的免疫活性，主要干预机体氨基酸代谢(甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，谷胱甘肽代谢，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成)和能量代谢(甘油脂代谢，乙醛酸及二羧酸代谢，丙酮酸代谢，淀粉和蔗糖代谢，半乳糖代谢)。在CTX模型上以氨基酸代谢为主，在HC模型上以能量代谢为主。
结论利用优选出的黄芪膜分离工艺分离纯化得到的M4部位对CTX、HC两种药物造成的免疫抑制模型均有一定的免疫调节作用。UPLC-MS技术分析得到的M4部位化学成分用于网络药理学的分析，使得网络药理学结果可信度更高。血清代谢组学分析得到的代谢通路，更完善地阐释了M4部位免疫调节作用机制。研究从药理学、网络药理学、血清代谢组学多角度，以CTX、HC两种模型，对黄芪药材膜分离得到的小分子部位(M4部位)的免疫调节作用与机制进行研究，有利于黄芪中以皂苷类、黄酮类成分为主的小分子部位的进一步开发利用，为膜分离技术应用与开发利用提供了基础。