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拟南芥ERECTA基因家族包括AtER,AtER-LIKE1(AtERL1)和AtERL2三个成员,编码一种植物跨膜信号受体的亚族,在拟南芥的多种组织中广泛表达。已有多篇报道证明:ER家族基因通过协同作用协调细胞分裂和细胞增殖从而调节包括叶片、雌雄蕊和气孔在内的气生器官的产生和形态建成;参与多种生理过程如二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)羧化率(Carboxylation rate)、电子传递能力(Electron transport capacity)、植株的水分利用效率和蒸腾作用;参与植株对干旱和细菌感染等生物和非生物胁迫的响应。这些都证明了ERECTA基因在促进植物正常生长和发育中起到重要作用。然而ERECTA基因在水稻生长发育中的作用还未见报道,根据拟南芥ER基因的氨基酸序列,本研究在水稻基因组中预测到三个水稻ERECTA基因家族成员,在本研究中,本研究进一步分析了ERECTA基因在水稻中的表达模式和特征,并初步分析了其在水稻生长发育中的作用,为深入分析ERECTA基因对水稻生长发育的调控作用及调控机制奠定了基础。主要研究结果如下:
1 ERECTA基因在水稻中的表达模式
(1)利用生物信息学方法发现水稻中的ERECTA基因家族成员有三个,分别为:ERECTA(ER)(Os06g0203800),ERECTA-LIKE1(ERL1)(JN991005)和ERL2(Os06g0130100)。利用荧光定量PCR对ERECTA家族基因在根、茎、叶、旗叶和幼穗等器官中的表达水平进行分析,发现ERECTA家族基因在根中几乎检测不到,在成熟的地上器官如叶片、茎、旗叶中表达水平较低,在分生组织或者生殖器官如幼穗中表达水平较高。
(2)利用荧光定量PCR分析ERECTA家族基因在红光和黑暗条件下生长的野生型水稻和phyB突变体水稻中的表达水平。结果发现,在红光条件下生长的野生型水稻中的ERECTA家族基因的表达水平比黑暗条件下的表达水平低,这说明红光抑制ERECTA家族基因的表达,而红光条件下生长的phyB突变体的这种受抑制作用被大大减弱,这说明phyB在红光抑制ERECTA家族基因表达中具有重要作用。然而在phyAphyB双突变体中,红光不能一直ERECTA家族基因的表达。上述结果表明,phyA和phyB均能感受红光信号抑制ERECTA家族基因的表达。
2内含子在ERECTA基因表达中具有重要作用
培育含有部分ERL1基因cDNA(cERL1)和与之相对的包含内含子ERL1基因DNA片段(gERL1)的转基因水稻,并利用RT-PCR技术分析两种转基因水稻中ERL1基因的表达水平。结果表明:cERL1的转基因植株中ERL1基因的表达水平没有显著变化,而gERL1转基因水稻中ERL1基因的表达水平显著提高。这表明内含子的存在是ERL1基因表达所必需的。
3 ERECTA基因在水稻生长发育中的作用
(1) ERL1基因的过量表达提高了水稻的抗旱能力。通过对野生型水稻和gERL1过表达的转基因水稻进行PEG处理以模拟干旱条件。结果发现:当PEG-4000(15%)处理8天时,野生型植株的叶片出现萎蔫,颜色变黄,而转基因株系仍可以维持一定膨压且叶片颜色正常。PEG-4000(15%)处理16天后复水8天时,野生型水稻植株几乎全部枯萎未能恢复正常,而转基因植物大部分能够恢复到叶片颜色转绿的状态。这表明ERL1基因的过量表达提高了水稻的抗旱能力。
(2)对培育的gERL1转基因植株进行鉴定和表型观察发现T1代转基因水稻种子长度同野生型相比增大,据此推测ERL1基因可能参与调控器官大小。
(3)本研究从水稻TOS17转座子突变体库中筛选到ERL2基因的突变体株系erl2,并鉴定了该突变体为单位点插入突变。突变体表型分析表明erl2突变体植株营养生长正常但其育性显著降低,对突变体植株的雌蕊和雄蕊的表型进一步观察发现突变体的雌蕊表型正常而花药长度显著降低。
4水稻ERECTA基因编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶
通过构建带有maltose binding protein(MBP)标签的pMal-ER融合蛋白原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中诱导表达。收集大肠杆菌表达得到的蛋白并利用MBP标签纯化得到MBP-ER,对此重组蛋白进行氨基酸磷酸化分析(Phosphoaminoacid analysis),结果证明ER蛋白能够在丝氨酸和苏氨酸残基处发生自磷酸化反应。这说明水稻ERECTA基因编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。