番荔枝果实Expansin基因的克隆及其表达分析

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番荔枝广泛分布于热带和较温暖的亚热带地区,在我国华南地区普遍种植。番荔枝属于呼吸跃变型果实,采后的果实在常温条件下贮藏极易软化、裂果。番荔枝的贮藏特性严重的缩短了其果实的贮藏寿命和货架期,制约了其流通贸易。大量研究表明,expansin(扩张蛋白)基因作为细胞壁的松弛因子与果实的成熟软化密切相关,然而,番荔枝采后贮藏过程中的果实软化、裂果是否与expansin基因的表达特性有关目前尚未见报道。本试验以AP(AnnonaatemoyaHortexcv.AP)番荔枝果实为材料,在分离果实expansin基因全长序列的基础上,研究expansin基因在番荔枝果实不同生长时期、成熟及软化进程的表达特征,并探讨采后不同贮藏温度对果实软化的影响及其与该基因表达的关系,期望阐明expansin基因与番荔枝果实生长、成熟软化的关系,为延长番荔枝的贮藏保鲜期提供理论依据。本文的主要研究结果如下: 1.采用RT-PCR与RACE-PCR相结合方法,首次从番荔枝果实中分离到3个expansincDNAs的全长序列,分别命名为As-Expl、As-Exp2和As-Exp3。As-Exp1、As-Exp2和As-Exp3基因全长分别有¨70bp、1230bp和996bp。As-Exp1、As-Exp2和As-Exp3翻译区分别包含有744bp、768bp和777bp组成的完整的开放阅读框架(ORF),并分别编码248、256和259个氨基酸。其中,As-Exp1的3’端和5’端不翻译区分别包含61bp和365bp;As-Exp2的3’端和5’端不翻译区分别包含125bp和337bp;As-Exp3的3’端和5’端不翻译区分别包含41bp和178bp。3个基因彼此间的同源性很高,而且由核苷酸推导的氨基酸序列均含有expansin基因的保守区域即:8个半胱氨酸残基(C),在C一末端存在4个色氨酸残基(W)和1个组氨酸一苯丙氨酸一天冬氨酸(HFD)区域。 2.As-Exp1、As-Exp2和As-Exp3在番荔枝果实的不同的生长发育阶段表达存在一致性。As-Exp1、As-Exp2和As-Exp3在番荔枝果实的整个生长发育阶段均能被检测到,随着果实的生长,3个基因表现出同样的逐渐增强的趋势,说明3个基因与果实的生长发育相关。同时,在田间自然裂果的果实中,As-Exp1、As-Exp2和As-Exp3的表达都很强烈,说明在果实的自然裂果也与3种基因的表达有关。 3.低温(10℃、15℃)贮藏能够明显抑制果实的呼吸速率和乙烯的释放量,同时,延缓果肉硬度和洲值的下降。20℃条件下贮藏至第五天起乙烯释放量达到最大值,为1200ul/mg.h;在15℃贮藏下,果实乙烯释放量呈现逐渐上升的趋势,但其乙烯释放量明显比20℃下贮藏的果实释放量低,贮藏至第六天乙烯释放量达到最大值,其最大值为200u1.mg-1.h-1,明显低于20℃下的最大值;同样,果实的呼吸速率也表现出同样的趋势;而10℃下,果实的呼吸速率和乙烯的释放量变化比较平缓,呼吸速率和乙烯释放量都很低。另外,随着果实贮藏时间的延长,果肉洲和硬度均呈现下降的趋势。20℃下贮藏的果实,果肉pH从贮藏的第二天便明显下降,至贮藏的第四天时,果肉硬度也开始明显下降;15℃下果实贮藏到第五天开始其硬度和洲值均有明显的下降,但其变化没有20(2贮藏下的下降迅速;而10℃下其硬度和pH值变化均比较的平缓。 4.采用Northern杂交方法研究了expansin基因表达特征与采后番荔枝果实成熟软化的关系。研究结果表明,在不同温度下,贮藏前期的番荔枝果实不能检测到As-Exp2~As-Exp3mRNA的表达,但随着贮藏时期的延长,As-Exp2~As-Exp?mRNA的积累量则不断增加。同时,三种基因表达随贮藏温度的升高而增强,并且随着贮藏时间的延长而表达强烈,由此说明,As-Exp1、As-Exp2~As-Exp3屿番荔枝果实的成熟软化相关,并[513个基因的表达均受温度的调控。 5.1000ppm丙烯处理在加速贮藏于常温下番荔枝果实的软化进程的同时,也能促进了As-Exp1、As-Exp2~IIAs-Exp3在果肉中的表达。丙烯处理促进了呼吸速率和乙烯释放量的增加,加速了果肉硬度和pH值的下降;As-Exp1、As-Exp2和As-Exp3~丙烯处理后的番荔枝果实整个贮藏期均被检测到,并且三个基因的表达都比未经丙烯处理的果实果肉表达强烈,并且,随着贮藏时期的延长均有逐渐增强的趋势,说明Expansin基因的表达受到丙烯的调控并且与果实软化密切相关。
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