论文部分内容阅读
第一部分 SHIP-1条件性敲除对调节性T 细胞发育及功能的影响机制研究 目的：以SHIP-1条件性敲除小鼠为动物模型;通过条件性敲除的方法;在调节性T细胞中条件性敲除SHIP-1基因;观察其对调节性T细胞发育及功能的影响;探讨 SHIP-1 参与自身免疫耐受及免疫稳态建立与维持的可能机制;为自身免疫性疾病及炎症性疾病的防治提供理论依据。 方法：对象：将 SHIPfl/fl小鼠与 Foxp3-YFP-cre 小鼠杂交后得到的4-6周龄SHIP条件性敲除小鼠（SHIPfl/flFoxp3-YFP-cre）;建立实验组 （ SHIP-KO 组 ） 。 以 周 龄 及 性 别 相 匹 配 的 基 因 型 为SHIP+/+Foxp3-YFP-cre 的小鼠建立对照组（WT 组）。所有小鼠均为C57BL/6背景且均在SPF环境下饲养。方法:(1)观察各组小鼠的生长发育情况;相关症状表现及淋巴结脾脏等主要免疫器官的大体形态学变化（2）HE 染色观察个组小鼠肺部;肝脏;肾脏;肠道的组织病理形态学变化（3）ELISA检测各组小鼠血清中dsDNA特异性IgG的水平 （4）流式细胞术分析各组小鼠胸腺及外周免疫器官的相关免疫表型。（5）体外诱导Foxp3分子表达;联合流式细胞术检测各组小鼠胸腺中CD4SPCD25+Foxp3-T细胞的分化潜能（6）调节性T细胞体外抑制功能实验联合流式细胞术检测各组小鼠调节性T细胞的功能。 结果：（1）SHIP-KO组小鼠生长发育明显落后于WT组;表现为体重及身长明显低于WT组;所有SHIP-KO组小鼠均出现明显的脱毛现象而WT组小鼠未出现该现象;所有SHIP-KO组小鼠脾脏及淋巴结均比WT组小鼠明显增大 ;且部分条件性敲除小鼠在未满4周龄时即出现死亡。（2）HE染色可见SHIP-KO组小鼠肺部;肝脏;小肠组织较WT组小鼠炎症细胞浸润明显;SHIP-KO组小鼠较WT组小鼠肾小球体积明显增大;肾小球球内系膜细胞增生明显。（3）SHIP-KO组小鼠血清中dsDNA特异性IgG水平较WT组小鼠有增高的趋势 （4）流式细胞术分析两组小鼠胸腺及外周免疫器官的相关免疫表型：在胸腺中 ; SHIP-KO 组 小 鼠 CD4SP ; CD8SP ; CD4SPFoxp3+ ; CD4SPCD25+Foxp3- ;CD4SPCD25+Foxp3+T细胞的百分比明显高于WT组。在脾脏及外周淋巴结中;SHIP-KO组小鼠CD4SP及CD8SP T细胞的绝对数及百分比明显低于WT组;CD4SP Foxp3+T细胞的百分比明显高于WT组;但绝对数确较WT组下降;调节性T细胞中GITR及PD-1的表达明显高于WT组;初始T细胞（CD44-CD62L+）的百分比较WT组显著下降;记忆性T细胞（CD44+CD62L-）的百分比较WT组显著升高;生发中心B细胞（GC）及滤泡辅助性T细胞（Tfh）的比例均较WT组有所升高。（5）体外培养及诱导分化可见SHIP-KO 组小鼠胸腺CD4SPCD25+Foxp3-T细胞的分化能力高于WT组。（6）调节性T细胞功能检测可见SHIP-KO组小鼠调节性T细胞对初始T细胞增殖及分泌细胞因子的抑制作用较WT组明显减弱。 结论：（1）SHIP-1 在调节性 T 细胞的胸腺发育及分化过程中可能发挥负向调控作用（2）SHIP-1对于调节性T细胞免疫抑制功能的发挥及谱系稳定性维持是必要的。当SHIP-1在调节性T细胞中的表达下降或缺失时;将导致调节性 T 细胞功能及谱系稳定性的破坏;机体自身免疫耐受被打破;从而可能导致自身免疫性疾病及炎症性疾病的发生。 第二部分 饥饿激素持续十二指肠灌注影响肝糖代谢的分子机制研究 目的:研究饥饿激素持续十二指肠灌注;经“肠-脑-肝轴”途径影响肝糖代谢的相关分子机制。 方法: 在预先建立的十二指肠输注、迷走神经肝支离断、第四脑室孤束核输注等动物模型的基础上;给予大鼠十二指肠灌注饥饿激素、丁卡因和生理盐水处理。并随机分为 8 组：饥饿激素灌注组(Ghrelin 组;n=5);丁卡因灌注组(tetracaine 组;n=5);生理盐水灌注组（saline组;n=5）;饥饿激素及丁卡因同时灌注组（Ghrelin+ tetracaine组;n=5）;迷走神经肝支离断同时饥饿激素灌注组（Ghrelin+HVAG组;n=5）;迷走神经肝支离断同时生理盐水灌注组（HVAG组;n=5）; MK-801 第四脑室孤束核微量灌注同时饥饿激素灌注组（ Ghrelin+MK-801组;n=5）;MK-801第四脑室孤束核微量灌注同时生理盐水灌注组（MK-801组;n=5）。用Realtime-PCR及Western-blot技术检测各组大鼠肝脏中G6Pase;PEPCK;PGC-1α 的mRNA及蛋白的表达水平。 结果：Ghrelin组肝脏G6Pase;PEPCK;PGC-1α ;mRNA及蛋白表达水平均显著高于其他各组（均P<0.05）。 结论：饥饿激素持续十二指肠灌注可能通过 G6Pase;PEPCK; PGC-1α 等分子机制;影响肝糖代谢。