【摘 要】
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细胞生命活动的调控在分子水平表现为蛋白质．蛋白质相互作用的调节。此调节可部分通过可逆性蛋白质共价修饰来进行。SUMO(small ubiquitin-like modifier)是近年来发现的在结
【出 处】
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西北农林科技大学 西北农林科技大学
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细胞生命活动的调控在分子水平表现为蛋白质．蛋白质相互作用的调节。此调节可部分通过可逆性蛋白质共价修饰来进行。SUMO(small ubiquitin-like modifier)是近年来发现的在结构上类似于泛素的一类小分子蛋白质修饰物，目前已发现有4种SUMO家族蛋白，SUMO-1，-2，-3,-4和至少50种SUMO修饰的底物被鉴定。SUMO通过与靶蛋白共价结合修饰广泛参与蛋白质转录、核内转运与定位、信号转导和维持基因组稳定等功能。
本试验以SUMO第二类家族成员SUMO-3为研究对象。我们首先通过PCR从pYFP-SUMO-3获得SUMO-3GG，然后构建了SUMO-3GG基因的原核表达载体，获得重组质粒pET41a(+)-SUMO-3；构建真核表达载体，获得重组质粒pCMV-HA-SUMO-3、pCMV-Myc-SUMO-3、pEGFP-C1-SUMO-3、pDsRed-C1-SUMO-3。
将pET41 a(+)-SUMO-3转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3) plysS，IPTG进行诱导表达，SDS-PAGE和Western Blot结果表明融合蛋白GST-SUMO-3在BL21(DE3)plysS中得到了高效表达，融合蛋白表观分子量约为44.0 kDa。经GST亲和柱层析进一步纯化获得了可溶性重组蛋白。以纯化的融合蛋白GST-SUMO-3作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体，并利用ELISA、Western blot检测抗体的灵敏度和特异性。结果表明原核载体构建成功，多克隆抗体效价为1:6000;可以特异性识别内源性SUMO-3蛋白。
将真核表达载体pEGFP-C1-SUMO-3利用脂质体转染法转染到Hela细胞中瞬时表达，在荧光显微镜下观察SUMO-3蛋白的亚细胞结构定位。将真核表达载体pDsRed-C1-SUMO-3和pEGFP-C1-p53利用脂质体转染法共转染到Hela细胞中进行瞬时表达，在荧光显微镜下观察蛋白的共定位情况。结果表明真核载体在Hela，细胞内成功表达；SUMO-3蛋白定位在核内中，与p53蛋白共定位在核内。
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