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基因打靶通过DNA转移手段将外源DNA导入靶细胞或组织中，利用外源DNA序列与靶细胞内基因组中部分DNA序列间的同源性使它们在分裂前期发生DNA间的同源重组，从而对靶细胞基因组上的某一确定位点或座位进行精确的遗传修饰的一门新技术。乳腺生物反应器是基于胚胎操作和转基因技术平台，外源基因导入动物基因组中并利用内源基因的启动元件使外源基因在动物乳腺中表达，并利用动物乳腺的分泌能力从乳汁中获得具有重要使用价值的药用蛋白等外源蛋白的一类转基因动物的总称。随机整合将外源基因随机导入靶细胞基因组中，由于“位置效应”而导致外源基因表达低下甚至沉默。为提高外源蛋白在转基因动物中的表达量，本研究以基因打靶等技术构建山羊乳腺特异性载体，并通过稳定转染和细胞筛选来获得中靶转基因山羊胎儿成纤维细胞，以中靶体细胞为核供体细胞生产乳腺生物反应器动物，解决了外源基因由于随机整合而产生“位置效应”这一难题，并利用乳蛋白基因的启动元件在乳腺中高效表达外源基因。
本试验以山羊β-酪蛋白基因座为打靶位点，从西农萨能奶山羊血液中提取DNA基因组，利用LA-PCR分两段扩增了山羊的β-酪蛋白基因，经TA克隆和鉴定后再用LA-PCR的方法从中克隆了该基因的5’端包括调控序列和信号肽在内的3 kb的DNA序列和3端2 kb的DNA序列作为两条同源臂。同时以在两个LoxP之间插有新霉素磷酸转移酶基因(neo)并在两个LoxP外侧各有一个疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)的通用性打靶载体pA2T为骨架载体，构建了乳腺特异性条件性基因打靶载体。
采用具有广谱抗菌、抗病毒、改善免疫、组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等作用的人溶菌酶基因和具有溶解血块、保持血管的畅通等作用且半衰期相对较长的指形区缺乏的人组织纤溶酶原激活剂基因为打靶载体的外源目的基因，两者均通过PCR从带有该基因的载体中克隆出来的，并通过酶切和连接的方法构建打靶载体。另外，试验以带有核定位信号的AcGFP基因为标记基因，外源目的基因通过具有独立起始翻译随后基因作用的IRES序列与AcGFP基因相联系。
以质粒pEGFP-C1为骨架载体，先通过改造GFP基因ATG附近的序列使GFP高效表达，再将具有增强剪接作用的间插序列(IVS)与IRES序列与GFP基因相连，再在IVS前加入另一个带有多克隆位点的IVS，构建了载体p3I-GFP，通过细胞转染确实发现载体p3I-GFP及去除了MluI位点的p3I-GFPN能够高效表达标记基因，且荧光亮度要明显高于购买的pIRES2-AcGFP-Nuc载体。再以p3I-GFPN为骨架载体，将人溶菌酶基因导入多克隆位点，通过细胞转染发现的确能够表达绿色荧光蛋白。在此基础上，在CMV启动子和人溶菌酶基因之间插入山羊CSN2的启动子，再将GFP基因用从人胎盘中以PCR的方法扩增获得的干扰素A基因替代，最终构建了一个乳腺中独立表达人溶菌酶和人干扰素蛋白的载体，用于乳腺炎防治的研究。为获得中靶山羊胎儿成纤维细胞株，本试验以山羊胎儿成纤维细胞为打靶体细胞，脂质体2000转染细胞后用含800 μg/ml的遗传霉素初步筛选培养，7天后用含400μg/ml的遗传霉素和200 nmo1/m1的丙氧鸟苷的细胞筛选液筛选培养，初步筛选中靶细胞。为获得纯化的中靶细胞株，首先建立一个单细胞培养体系，即以5 mg/ml丝裂霉素C处理2h的山羊胎儿成纤维细胞为饲养层和新鲜的细胞培养液，以这个单细胞培养体系培养初步筛选的中靶单个细胞，最后得到扩增的细胞株，再用含400 μg/ml的遗传霉素和100nmol/ml的丙氧鸟苷的细胞培养液培养，获得纯化的中靶山羊胎儿成纤维细胞株。