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绒山羊是我国珍贵的家畜遗传资源，其中的阿尔巴斯绒山羊经过长期自然选择和人工选育成为了世界一流的品种，其羊绒在国际上享有“纤维宝石”、“软黄金”的盛誉。然而长期以来，由于没有对该品种形成科学的种质资源保护意识，盲目将当地品种与外来品种杂交，导致种群资源呈现退化趋势。为进一步保护和开发该优良种质资源，利用现代生物育种技术培育优质高产绒量绒山羊，成为了该品种种质资源保护和创新利用的有效方式。毛囊的生长发育对羊绒产量和品质具有重要影响，因此，筛选研究影响毛囊生长发育的关键基因成为突破重点。本研究以探究Tβ4在绒山羊毛囊生长发育过程中的功能为目标，从三个层面纵深开展研究。
一、目标基因的筛选及对其在绒山羊毛囊细胞模型上的功能研究
为筛选鉴定影响绒山羊毛囊生长发育的关键基因，深入分析了绒山羊毛囊静止期和生长期的皮肤样本和两个时期的次级毛囊毛乳头细胞（dermal papilla cells of secondary hair follicle，SHF-DPC）的高通量转录组测序数据，将四个数据集的80个共同差异表达基因（differentially expressed genes，DEG）作为初步筛选范围。通过对其进行基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析以及蛋白质互作网络（protein-protein interaction network，PPI）的构建，进一步筛选鉴定出5个候选基因。在对5个候选基因进行基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）的基础上，经过实验验证，最终筛选确定胸腺素β4（Thymosinβ4，Tβ4）为目标研究基因。Tβ4是一种最早从牛胸腺中分离提取的高度保守的G-肌动蛋白偶联蛋白，由43个氨基酸残基组成。该分子参与了包括促进细胞迁移、血管生成、伤口愈合等多种生物学过程，特别是在小鼠毛囊生长发育中起到关键作用。然而，Tβ4在绒山羊毛囊中的研究却鲜有报道。
为进一步在毛囊细胞模型上解析Tβ4对绒山羊毛囊生长发育的影响，构建了Tβ4过表达和RNAi（RNA interference）敲减载体，完成了对SHF-DPC的体外培养及鉴定。当在SHF-DPC中转染Tβ4过表达（Tβ4-OE）载体后，对两种细胞进行EdU细胞增殖检测，与CTL（Control）组相比，Tβ4-OE组的细胞增殖能力提高。当敲减SHF-DPC中的Tβ4（Tβ4-KD）后，与CTL组相比，Tβ4-KD组的细胞增殖能力减弱。当在Tβ4-KD组再转入Tβ4-OE载体（Tβ4-KD-OE）后，与Tβ4-KD组相比，Tβ4-KD-OE组的细胞增殖能力恢复。通过在SHF-DPC中正反调控Tβ4基因表达水平，从而明确Tβ4能够促进SHF-DPC的增殖能力，说明其在绒山羊毛囊生长发育过程中发挥了重要作用。以上结果为进一步制备Tβ4基因修饰绒山羊奠定了理论基础。
二、Tβ4基因修饰原代绒山羊的制备及其对产绒性能改善的研究
为制备毛囊特异性表达Tβ4基因修饰绒山羊，建立了由毛囊特异性启动子KAP6.1驱动的Tβ4过表达核供体细胞系，利用体细胞核移植技术（somatic cell nuclear transfer，SCNT）将其移入去核卵母细胞，获得了1155枚重构胚胎并将其移入241例受体羊，成功制备了15只Tβ4基因修饰绒山羊。对其持续监测显示，在身体指标方面，Tβ4基因修饰绒山羊各项生理指标与野生型（wild type，WT）相比无显著性差异；在绒毛指标方面，Tβ4基因修饰绒山羊羊绒产量显著提高，最多可提高380g，羊绒厚度和羊毛长度与WT相比无显著性差异。
为进一步分析Tβ4与绒山羊毛囊生长发育及其产绒性能的相关性，将羊绒产量显著提高（Tβ4+组）和未显著提高（Tβ4-组）的Tβ4基因修饰绒山羊与WT组作对比。Southern Blot检测显示，与WT组相比，Tβ4+组和Tβ4-组的基因组中Tβ4基因拷贝数明显增多。实时定量PCR和免疫印迹检测显示，与WT组相比，Tβ4+组中Tβ4表达量显著提高，Tβ4-组中Tβ4表达量与WT组相比无显著性差异。以上结果提示，Tβ4-组中Tβ4基因表达受到抑制，产生了基因沉默现象。皮肤组织石蜡切片Hematoxylin-eosin（H&E）染色比较显示，与WT组相比，Tβ4+组的绒毛比率显著提高，Tβ4-组的绒毛比率与WT组无显著性差异。以上结果表明，Tβ4基因修饰绒山羊可以通过增加SHF数量提高羊绒产量。
为进一步阐明Tβ4影响毛囊生长发育及产绒性能的内在机制，通过转录组学和蛋白质组学联合分析，筛选出717个Tβ4+组和WT组的DEG，鉴定出177种与Tβ4互作的蛋白质。在EdU细胞增殖检测基础上，最终确定角质蛋白4（keratin4，KRT4）可与Tβ4互作影响绒山羊毛囊生长发育及产绒性能改善。在此基础上，分析了Tβ4-KRT4轴潜在的下游信号通路。与WT组相比，Tβ4+组ERK及磷酸化ERK水平显著提高，Tβ4-组ERK及磷酸化ERK水平与WT组无显著性差异。以上结果提示，Tβ4与KRT4互作可经由ERK信号通路影响绒山羊毛囊生长发育及产绒性能改善。
三、Tβ4基因修饰后代绒山羊的制备及其产绒性能遗传稳定性的研究
为选育稳定遗传优良产绒性能的后代，通过SCNT和自然繁育（natural mating，NM）两种方法，分两年成功建立起了23只Tβ4基因修饰绒山羊后代群体。对其持续监测显示，在身体指标方面，SCNT组和NM组的各项生理指标正常，与WT组无显著性差异；在绒毛指标方面，与WT组相比，SCNT组的产绒量显著提高，最多可提高320g。NM组的产绒量与WT组无显著性差异。同时，SCNT组和NM组的羊绒厚度和羊毛长度与WT组相比均无显著性差异。以上结果表明，SCNT组的产绒性能遗传稳定性高于NM组。
为进一步分析其产绒性能遗传稳定性与Tβ4基因的关系，对Tβ4基因进行了不同层面的检测。绝对定量PCR检测显示，SCNT组和NM组的Tβ4基因拷贝数均比WT组多。然而，免疫组织化学检测显示，与WT组相比，SCNT组Tβ4表达量较高，NM组Tβ4表达量与WT组无显著性差异。同时，实时定量PCR和免疫印迹检测可与免疫组化检测相互印证。以上结果提示，Tβ4基因发生表观修饰是导致SCNT组和NM组产绒性能遗传稳定性差异的主要原因。
为进一步探究表观修饰对世代间产绒性能遗传稳定性的影响，对Tβ4基因修饰绒山羊世代间样本进行了全基因组甲基化和转录组联合分析，筛选得到世代间94个DEG和1089个差异甲基化区域（differentially methylated regions，DMR），鉴定出2个甲基化驱动基因。DMR和DEG的GO功能富集分析表明，二者结果高度一致，提示DMR和DEG通过同一方式影响产绒性能的遗传稳定性。DMR和DEG的KEGG通路富集分析表明，二者差异较大，提示DMR和DEG可通过不同的信号通路影响产绒性能的遗传稳定性。
综上所述，Tβ4在绒山羊毛囊生长发育过程中起到了重要的作用，对改善绒山羊的产绒性能具有重要的理论和现实意义。
一、目标基因的筛选及对其在绒山羊毛囊细胞模型上的功能研究
为筛选鉴定影响绒山羊毛囊生长发育的关键基因，深入分析了绒山羊毛囊静止期和生长期的皮肤样本和两个时期的次级毛囊毛乳头细胞（dermal papilla cells of secondary hair follicle，SHF-DPC）的高通量转录组测序数据，将四个数据集的80个共同差异表达基因（differentially expressed genes，DEG）作为初步筛选范围。通过对其进行基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析以及蛋白质互作网络（protein-protein interaction network，PPI）的构建，进一步筛选鉴定出5个候选基因。在对5个候选基因进行基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）的基础上，经过实验验证，最终筛选确定胸腺素β4（Thymosinβ4，Tβ4）为目标研究基因。Tβ4是一种最早从牛胸腺中分离提取的高度保守的G-肌动蛋白偶联蛋白，由43个氨基酸残基组成。该分子参与了包括促进细胞迁移、血管生成、伤口愈合等多种生物学过程，特别是在小鼠毛囊生长发育中起到关键作用。然而，Tβ4在绒山羊毛囊中的研究却鲜有报道。
为进一步在毛囊细胞模型上解析Tβ4对绒山羊毛囊生长发育的影响，构建了Tβ4过表达和RNAi（RNA interference）敲减载体，完成了对SHF-DPC的体外培养及鉴定。当在SHF-DPC中转染Tβ4过表达（Tβ4-OE）载体后，对两种细胞进行EdU细胞增殖检测，与CTL（Control）组相比，Tβ4-OE组的细胞增殖能力提高。当敲减SHF-DPC中的Tβ4（Tβ4-KD）后，与CTL组相比，Tβ4-KD组的细胞增殖能力减弱。当在Tβ4-KD组再转入Tβ4-OE载体（Tβ4-KD-OE）后，与Tβ4-KD组相比，Tβ4-KD-OE组的细胞增殖能力恢复。通过在SHF-DPC中正反调控Tβ4基因表达水平，从而明确Tβ4能够促进SHF-DPC的增殖能力，说明其在绒山羊毛囊生长发育过程中发挥了重要作用。以上结果为进一步制备Tβ4基因修饰绒山羊奠定了理论基础。
二、Tβ4基因修饰原代绒山羊的制备及其对产绒性能改善的研究
为制备毛囊特异性表达Tβ4基因修饰绒山羊，建立了由毛囊特异性启动子KAP6.1驱动的Tβ4过表达核供体细胞系，利用体细胞核移植技术（somatic cell nuclear transfer，SCNT）将其移入去核卵母细胞，获得了1155枚重构胚胎并将其移入241例受体羊，成功制备了15只Tβ4基因修饰绒山羊。对其持续监测显示，在身体指标方面，Tβ4基因修饰绒山羊各项生理指标与野生型（wild type，WT）相比无显著性差异；在绒毛指标方面，Tβ4基因修饰绒山羊羊绒产量显著提高，最多可提高380g，羊绒厚度和羊毛长度与WT相比无显著性差异。
为进一步分析Tβ4与绒山羊毛囊生长发育及其产绒性能的相关性，将羊绒产量显著提高（Tβ4+组）和未显著提高（Tβ4-组）的Tβ4基因修饰绒山羊与WT组作对比。Southern Blot检测显示，与WT组相比，Tβ4+组和Tβ4-组的基因组中Tβ4基因拷贝数明显增多。实时定量PCR和免疫印迹检测显示，与WT组相比，Tβ4+组中Tβ4表达量显著提高，Tβ4-组中Tβ4表达量与WT组相比无显著性差异。以上结果提示，Tβ4-组中Tβ4基因表达受到抑制，产生了基因沉默现象。皮肤组织石蜡切片Hematoxylin-eosin（H&E）染色比较显示，与WT组相比，Tβ4+组的绒毛比率显著提高，Tβ4-组的绒毛比率与WT组无显著性差异。以上结果表明，Tβ4基因修饰绒山羊可以通过增加SHF数量提高羊绒产量。
为进一步阐明Tβ4影响毛囊生长发育及产绒性能的内在机制，通过转录组学和蛋白质组学联合分析，筛选出717个Tβ4+组和WT组的DEG，鉴定出177种与Tβ4互作的蛋白质。在EdU细胞增殖检测基础上，最终确定角质蛋白4（keratin4，KRT4）可与Tβ4互作影响绒山羊毛囊生长发育及产绒性能改善。在此基础上，分析了Tβ4-KRT4轴潜在的下游信号通路。与WT组相比，Tβ4+组ERK及磷酸化ERK水平显著提高，Tβ4-组ERK及磷酸化ERK水平与WT组无显著性差异。以上结果提示，Tβ4与KRT4互作可经由ERK信号通路影响绒山羊毛囊生长发育及产绒性能改善。
三、Tβ4基因修饰后代绒山羊的制备及其产绒性能遗传稳定性的研究
为选育稳定遗传优良产绒性能的后代，通过SCNT和自然繁育（natural mating，NM）两种方法，分两年成功建立起了23只Tβ4基因修饰绒山羊后代群体。对其持续监测显示，在身体指标方面，SCNT组和NM组的各项生理指标正常，与WT组无显著性差异；在绒毛指标方面，与WT组相比，SCNT组的产绒量显著提高，最多可提高320g。NM组的产绒量与WT组无显著性差异。同时，SCNT组和NM组的羊绒厚度和羊毛长度与WT组相比均无显著性差异。以上结果表明，SCNT组的产绒性能遗传稳定性高于NM组。
为进一步分析其产绒性能遗传稳定性与Tβ4基因的关系，对Tβ4基因进行了不同层面的检测。绝对定量PCR检测显示，SCNT组和NM组的Tβ4基因拷贝数均比WT组多。然而，免疫组织化学检测显示，与WT组相比，SCNT组Tβ4表达量较高，NM组Tβ4表达量与WT组无显著性差异。同时，实时定量PCR和免疫印迹检测可与免疫组化检测相互印证。以上结果提示，Tβ4基因发生表观修饰是导致SCNT组和NM组产绒性能遗传稳定性差异的主要原因。
为进一步探究表观修饰对世代间产绒性能遗传稳定性的影响，对Tβ4基因修饰绒山羊世代间样本进行了全基因组甲基化和转录组联合分析，筛选得到世代间94个DEG和1089个差异甲基化区域（differentially methylated regions，DMR），鉴定出2个甲基化驱动基因。DMR和DEG的GO功能富集分析表明，二者结果高度一致，提示DMR和DEG通过同一方式影响产绒性能的遗传稳定性。DMR和DEG的KEGG通路富集分析表明，二者差异较大，提示DMR和DEG可通过不同的信号通路影响产绒性能的遗传稳定性。
综上所述，Tβ4在绒山羊毛囊生长发育过程中起到了重要的作用，对改善绒山羊的产绒性能具有重要的理论和现实意义。