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黑胫病（Blackleg）是世界范围的油菜（Brassica napus）真菌病害，其病原菌为Leptosphaeria属的复合种，影响着油菜籽的产量和品质。该病害在澳大利亚、加拿大、欧洲、中国等油菜产区均有发生，制约着油菜产业的发展和国际贸易。目前，防治措施主要包括选育和栽培抗病油菜品种、科学的农艺管理，以及使用化学杀菌剂。甾醇脱甲基酶抑制剂（Steroldemethylation inhibitor,DMI）是一类广泛使用的杀菌剂，通过抑制靶标蛋白14?-脱甲基酶的生物活性，进而抑制病原菌细胞膜的合成，该靶标蛋白的编码基因为ERG11（亦称CYP51）。DMI单一作用位点的杀菌方式易造成病原真菌出现抗药性，已在众多植物病原菌中大量报道，包括2017年首次报道的黑胫病菌（Leptosphaeria maculans），但L.maculans对DMI的抗药性分子机理有待进一步研究。
本论文开展了油菜黑胫病菌L.maculans抗药性菌株的筛选和识别，并对田间抗药性菌株的抗药性水平、分子机理进行了系统研究，首次阐释了黑胫病菌L.maculans对DMI杀菌剂的抗药性分子机理，主要结果如下：
（1）采用“孢子浴”侵染油菜植株法（in planta），筛选并识别出6株具有DMI抗药性的L.maculans田间抗药性菌株，其能够侵染杀菌剂处理的油菜植株并产生显著性的叶面损伤，分别命名为18BL149-18BL154；与敏感菌株相比，抗药性菌株对4种DMI类杀菌剂的EC50值均不同程度的增加，且对其中至少一种杀菌剂的EC50值显著性高于敏感菌株；同时5株抗药性菌株的环境适应性并未显著性下降，仅菌株18BL153的产孢量较敏感菌株降低，但其致病力未受影响；
（2）测序并分析抗药性菌株的ERG11基因编码区，未发现任何基因多态性变化；进一步对其启动子区（编码区上游1000bp区域）研究发现，在抗药性菌株18BL149、18BL150、18BL153的ERG11启动子区分别存在5267bp、5248bp、5263bp的基因片段插入，且插入位点不同；而在抗药性菌株18BL151、18BL152的ERG11启动子区的相同位置（-102bp）存在275bp的基因片段插入；插入片段的GenBank登录号为MN331773-MN331776；在菌株18BL154的ERG11启动子中未发现任何序列改变；
（3）对插入序列进一步比对分析得出，长度约为5000bp的三种插入序列均属于I型转座子（retrotransposon）Zolly-2家族，尽管这三种转座子插入的位置和长度不同，但是其两侧的长末端重复序列相似度高，且序列中包含DNA重复序列突变（Repeat-induced point mutation，RIP），遵循C-T和G-A的碱基替换规律；菌株18BL151和18BL152中的插入片段的序列完全相同，且在L.maculans的基因组上存在多个拷贝（>400），属于转座子Pholy家族；
（4）对靶标基因的表达量分析得出，启动子中的275bp、5263bp转座子插入显著性增加了抗药性菌株中ERG11基因的诱导表达量（induced expression），且可在杂交子代中稳定遗传，分离比例符合单一基因控制的遗传分离，证明启动子中的转座子插入导致了L.maculans抗药性的产生；另外，田间抗药性菌株中ERG11的相对表达量与其对戊唑醇的敏感性（EC50）之间呈显著正相关；
（5）克隆抗药性菌株的ERG11启动子、编码区及终止子区，并将其在敏感菌株中表达，使敏感菌株获得了DMI抗药性，且抗药性转化株的ERG11诱导表达量与其敏感性（EC50）之间呈显著正相关；
（6）通过PCR法将突变碱基引入靶标基因ERG11中，并将含碱基突变组合（I381V、Y459/G460缺失、W461G）的靶标基因ERG11在敏感菌株中表达，结果发现含有突变点的靶标基因显著增加了敏感菌株的抗药性，其抗性因子达15.82，且含突变点的抗药性转化株的环境适合度和致病力均未下降。
综上研究结果可得出结论：油菜黑胫病菌L.maculans对DMI类杀菌剂产生抗药性的分子机理为，靶标基因ERG11启动子区的转座子插入，上调ERG11的表达量，或者ERG11编码区存在I381V、Y459/G460缺失、W461G的碱基突变组合，均会导致L.maculans对DMI类杀菌剂产生抗药性。
本论文开展了油菜黑胫病菌L.maculans抗药性菌株的筛选和识别，并对田间抗药性菌株的抗药性水平、分子机理进行了系统研究，首次阐释了黑胫病菌L.maculans对DMI杀菌剂的抗药性分子机理，主要结果如下：
（1）采用“孢子浴”侵染油菜植株法（in planta），筛选并识别出6株具有DMI抗药性的L.maculans田间抗药性菌株，其能够侵染杀菌剂处理的油菜植株并产生显著性的叶面损伤，分别命名为18BL149-18BL154；与敏感菌株相比，抗药性菌株对4种DMI类杀菌剂的EC50值均不同程度的增加，且对其中至少一种杀菌剂的EC50值显著性高于敏感菌株；同时5株抗药性菌株的环境适应性并未显著性下降，仅菌株18BL153的产孢量较敏感菌株降低，但其致病力未受影响；
（2）测序并分析抗药性菌株的ERG11基因编码区，未发现任何基因多态性变化；进一步对其启动子区（编码区上游1000bp区域）研究发现，在抗药性菌株18BL149、18BL150、18BL153的ERG11启动子区分别存在5267bp、5248bp、5263bp的基因片段插入，且插入位点不同；而在抗药性菌株18BL151、18BL152的ERG11启动子区的相同位置（-102bp）存在275bp的基因片段插入；插入片段的GenBank登录号为MN331773-MN331776；在菌株18BL154的ERG11启动子中未发现任何序列改变；
（3）对插入序列进一步比对分析得出，长度约为5000bp的三种插入序列均属于I型转座子（retrotransposon）Zolly-2家族，尽管这三种转座子插入的位置和长度不同，但是其两侧的长末端重复序列相似度高，且序列中包含DNA重复序列突变（Repeat-induced point mutation，RIP），遵循C-T和G-A的碱基替换规律；菌株18BL151和18BL152中的插入片段的序列完全相同，且在L.maculans的基因组上存在多个拷贝（>400），属于转座子Pholy家族；
（4）对靶标基因的表达量分析得出，启动子中的275bp、5263bp转座子插入显著性增加了抗药性菌株中ERG11基因的诱导表达量（induced expression），且可在杂交子代中稳定遗传，分离比例符合单一基因控制的遗传分离，证明启动子中的转座子插入导致了L.maculans抗药性的产生；另外，田间抗药性菌株中ERG11的相对表达量与其对戊唑醇的敏感性（EC50）之间呈显著正相关；
（5）克隆抗药性菌株的ERG11启动子、编码区及终止子区，并将其在敏感菌株中表达，使敏感菌株获得了DMI抗药性，且抗药性转化株的ERG11诱导表达量与其敏感性（EC50）之间呈显著正相关；
（6）通过PCR法将突变碱基引入靶标基因ERG11中，并将含碱基突变组合（I381V、Y459/G460缺失、W461G）的靶标基因ERG11在敏感菌株中表达，结果发现含有突变点的靶标基因显著增加了敏感菌株的抗药性，其抗性因子达15.82，且含突变点的抗药性转化株的环境适合度和致病力均未下降。
综上研究结果可得出结论：油菜黑胫病菌L.maculans对DMI类杀菌剂产生抗药性的分子机理为，靶标基因ERG11启动子区的转座子插入，上调ERG11的表达量，或者ERG11编码区存在I381V、Y459/G460缺失、W461G的碱基突变组合，均会导致L.maculans对DMI类杀菌剂产生抗药性。